Giardia duodenum er en parasitisk organisme, der forårsager giardiasis, en tarminfektion, der især er almindelig hos små børn med kliniske tegn på diarré.Vi har tidligere rapporteret, at ekstracellulær G. duodenalis udløser aktiveringen af ​​intracellulær oligomeriseringslignende receptor 3 (NLRP3) bindende nukleotider og regulerer værtsinflammatoriske reaktioner gennem ekstracellulær vesikel (EV) sekretion.De nøjagtige molekylære mønstre af det patogen-associerede duodenokok EV (GEV), der er involveret i denne proces, og rollen af ​​NLRP3-inflammasomet i giardiasis mangler dog at blive belyst.
Rekombinante eukaryote ekspressionsplasmider pcDNA3.1(+)-alpha-2 og alpha-7.3 giardiner i GEV blev konstrueret, transficeret ind i muse primære peritoneale makrofager og påvist ved måling af inflammationsmålmolekylet caspase-1.p20-ekspressionsniveauet blev screenet..G. duodenalis alpha-2 og alpha-7.3 giardiner blev oprindeligt identificeret ved at måle NLRP3-inflammasom (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 og caspase-1 p20), IL-sekretion.1β-niveauer, apoptotisk plettet protein (ASC) oligomeriseringsniveauer og immunfluorescerende lokalisering af NLRP3 og ASC.NLRP3-inflammasomets rolle i patogeniciteten af ​​G. duodenalis blev derefter vurderet ved hjælp af mus, hvor NLRP3-aktivering var blokeret (NLRP3-blokerede mus), og patologiske ændringer i kropsvægt, duodenal parasitbelastning og duodenalt væv blev overvåget.Derudover undersøgte vi, om hiardiner alpha-2 og alpha-7.3 inducerer IL-1β-sekretion in vivo via NLRP3-inflammasomet og bestemte rollen af ​​disse molekyler i patogeniciteten af ​​G. duodenalis i mus.
Alfa-2- og alfa-7.3-giardiner inducerer aktiveringen af ​​NLRP3-inflammasomet in vitro.Dette førte til aktiveringen af ​​p20 caspase-1, en stigning i ekspressionsniveauerne af NLRP3, pro-IL-1β og pro-caspase-1 proteiner, en signifikant stigning i IL-1β sekretion, dannelsen af ​​ASA pletter i cytoplasma og induktion af ASA-oligomerisering.NLRP3-betændelse Penistab forværrer patogeniciteten af ​​G. duodenalis hos mus.Mus behandlet med cyster ved sonde fra NLRP3-blokerede mus udviste et øget antal trophozoiter og alvorlige skader på duodenale villi, karakteriseret ved nekrotiske krypter med krympede og forgrenede.In vivo eksperimenter har vist, at giardiner alpha-2 og alpha-7.3 kan inducere sekretion af IL-1β via NLRP3 inflammasomet, og immunisering med giardiner alpha-2 og alpha-7.3 reducerede patogeniciteten af ​​G. duodenalis hos mus.
Tilsammen tyder resultaterne af denne undersøgelse på, at giardia alpha-2 og alpha-7.3 forårsager opregulering af vært NLRP3-inflammation og reducerer smitteevnen af ​​G. duodenalis hos mus, som er lovende mål for at forhindre giardiasis.
Giardia duodenum er en ekstracellulær protozo-parasit, der lever i tyndtarmen og forårsager 280 millioner tilfælde af giardiasis med diarré årligt, især blandt små børn i udviklingslande [1].Folk bliver smittet af drikkevand eller mad, der er forurenet med M. duodenum-cyster, som derefter kommer ind i maven og udskilles i mavesaften.Giardia duodenum trophozoiter binder til duodenale epitel, hvilket forårsager kvalme, opkastning, diarré, mavesmerter og vægttab.Personer med immundefekt og cystisk fibrose er modtagelige for infektion.Infektion kan også forekomme gennem oral og analsex [2].Lægemidler som metronidazol, tinidazol og nitazoxanid er de foretrukne behandlingsmuligheder for duodenale infektioner [3].Imidlertid forårsager disse kemoterapilægemidler uønskede bivirkninger såsom kvalme, karcinogenese og genotoksicitet [4].Derfor skal der udvikles mere effektive strategier for at forhindre G. duodenalis-infektion.
Inflammasomer er en klasse af cytosoliske proteinkomplekser, der er en del af det medfødte immunrespons, der hjælper med at forsvare mod patogeninvasion og mediere inflammatoriske responser [5].Blandt disse inflammasomer er nukleotidbindende oligomerisering (NOD) receptor 3 (NLRP3) nukleotidbindende oligomerisering (NLRP3) nukleotidbindende-lignende inflammasom blevet grundigt undersøgt, fordi det kan påvises af forskellige patogen/skade-associerede molekylære mønstre (PAMP/ DAMP), genkender, aktiverer det medfødte immunsystem.og regulerer intestinal homeostase i mange inflammatoriske sygdomme [6,7,8].Det består af mønstergenkendelsesreceptoren (PRR) NLRP3, et apoptotisk plettet adapterprotein (ASC) og en effektor procaspase-1 eller procaspase-11.NLRP3-inflammasomet virker som vært mod patogeninvasion, som observeret i Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] og Leishmania undersøgelser.[11], men det er også blevet rapporteret, at aktivering af NLRP3-inflammasomet begrænser beskyttende immunresponser og forværrer sygdomsprogression, for eksempel hos orme [12].Baseret på vores tidligere resultater rapporterede vi, at ekstracellulær G. duodenalis udløser intracellulær aktivering af NLRP3-inflammation og modulerer værtsinflammatoriske responser ved at udskille ekstracellulære vesikler (EV'er) [13].Rollen af ​​NLRP3-inflammasomet i G. duodenalis-infektion in vivo mangler dog at blive bestemt.
Giardiner blev oprindeligt beskrevet som strukturelle komponenter i G. duodenalis cytoskelettet og spiller en vigtig rolle i trophozoitmotilitet og epitelcellebinding i tyndtarmen.For bedre at tilpasse sig miljøet og øge deres patogenicitet udviklede G. duodenalis trophozoites en unik cytoskeletstruktur bestående af 8 flageller, 1 mellemkrop og 1 ventral diskus [14].Trophozoitterne i Giardia duodenum bruger deres cytoskelet til at trænge ind i den øvre tyndtarm, især duodenum, og binde sig til enterocytter.De migrerer konstant og binder sig til epitelceller ved hjælp af cellemetabolisme.Derfor er der et tæt forhold mellem deres cytoskelet og virulens.Giardiner, der er specifikke for Giardia duodenum, er komponenter i cytoskeletstrukturen [15] og er opdelt i fire klasser: α-, β-, γ- og δ-giardiner.Der er 21 medlemmer af α-giardin-familien, som alle har en calciumafhængig evne til at binde fosfolipider [16].De forbinder også cytoskelettet til cellemembranen.Hos personer med diarré forårsaget af G. duodenalis er α-giardiner stærkt udtrykte og immunreaktive under infektion [17].Heterologe vacciner baseret på Giardia alfa-1 beskyttet mod giardiasis hos mus og er potentielle kandidatantigener til vaccineudvikling [18].Alfa-8 giardin, lokaliseret i plasmamembranen og flagellerne, men ikke i den ventrale skive, øger motiliteten og væksthastigheden af ​​trophozoitter i G. duodenalis [19].Alpha-14 giardin binder til mikrotubulus strukturer på flageller og påvirker levedygtigheden af ​​G. duodenalis [20].Alfa-11-giardin er til stede i overflod gennem hele livscyklussen, og overekspression af alfa-11-giardin beskadiger selve G. duodenalis [21].Det er dog uklart, om alpha-2-giardin og alpha-7.3-giardin er beskyttende mod G. duodenalis-infektion og deres underliggende mekanismer.
I denne undersøgelse blev rekombinante eukaryote ekspressionsplasmider pcDNA3.1(+)-alpha-2-giardin og pcDNA3.1(+)-alpha-7.3-giardin transficeret ind i muse primære peritoneale makrofager for at aktivere vært NLRP3.Inflammasommål blev derefter screenet.Vi vurderede også NLRP3-inflammasomets rolle i patogeniciteten af ​​G. duodenalis, undersøgte om alpha-2 og alpha-7,3-giardiner inducerer aktivering af NLRP3-inflammasomet in vivo og fastslog, at disse to roller af giardiner i patogeniciteten af G. duodenalis.Vores fælles mål var at udvikle lovende mål til forebyggelse af G. duodenalis-infektion.
Vildtype (WT) C57BL/6 hunmus i alderen 5-8 uger blev købt fra Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, Kina).Mus havde fri adgang til vand, modtog steriliseret mad og blev holdt i en 12/12 timers lys/mørke-cyklus.Før infektion fik mus antibiotika ad libitum i drikkevand suppleret med ampicillin (1 mg/ml), vancomycin (1 mg/ml) og neomycin (1,4 mg/ml) (alle købt fra Shanghai, Kina, kunstige organismer) [22 ].].Mus, der mistede evnen til at spise og drikke i > 24 timer og tabte ≥ 20 % kropsvægt, blev humant aflivet ved cervikal dislokation.
WB G. duodenalis trophozoites (American Type Culture Collection, Manassas, USA) blev suppleret med 12,5 % føtalt bovint serum (FBS; Every Green, Zhejiang, Kina) og 0,1 % bovin galde (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA) ).USA) under mikroaerobe forhold.Sammenflydende trophozoiter blev opsamlet på is og passeret i et forhold på 1:4 til yderligere reproduktion.
Giardia duodenum-cyster blev induceret som beskrevet tidligere [23], trophozoitter blev høstet i logaritmisk fase og derefter fortyndet med indkapslingsinducerende medium, pH 7,1 (modificeret TYI-S-33) til en slutkoncentration på 1 × 106 trophozoiter/ml.galdekoncentration 0,05 % medium).Trophozoitter blev dyrket under anaerobe betingelser ved 37°C indtil den logaritmiske vækstfase.Skift mediet til cyste-inducerende medium (pH 7,8; ​​modificeret TYI-S-33-medium med 1 % galdekoncentration) og dyrk G. duodenalis ved 37°C i 48-96 timer, hvor dannelsescyster blev observeret under et mikroskop.Efter at de fleste af trophozoitterne var blevet induceret til at danne cyster, blev kulturblandingen høstet og resuspenderet i sterilt deioniseret vand for at lysere de resterende trophozoiter.Cyster blev talt og opbevaret ved 4°C til efterfølgende analyser gennem et mavesonde i mus.
Giardia ekstracellulære vesikler (GEV'er) blev beriget som beskrevet tidligere [13].Trophozoitter i logaritmisk vækstfase blev resuspenderet i modificeret TYI-S-33-medium fremstillet med exosom-depleteret FBS (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) til en slutkoncentration på 1 × 106 parasitter/ml og inkuberet i 12 timer.blev isoleret fra kultursupernatanten ved centrifugering ved 2000 g i 10 minutter, 10.000 g i 45 minutter og 100.000 g i 60 minutter.Præcipitater blev opløst i phosphatbufret saltvand (PBS), kvantificeret ved anvendelse af et BCA-proteinassay-kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) og opbevaret ved -80°C eller anvendt direkte til yderligere analyser.
Primære muse peritoneale makrofager blev fremstillet som beskrevet tidligere [24].Kort fortalt blev mus (i alderen 6-8 uger) injiceret (intraperitonealt [ip]) med 2,5 ml 2,98% Difco flydende thioglycolmedium (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) og fodret med 3-4 ganer.En suspension af makrofager blev opsamlet fra abdominalhulen hos mus efter eutanasi og centrifugeret 3 gange ved 1000 g i 10 minutter.Høstede celler blev påvist ved flowcytometri under anvendelse af CD11b-markøren, indtil cellerenhed var >98%, derefter tilsat til 6-brønds cellekulturplader (4,5 x 106 celler/brønd) og inkuberet med 10% FBS (Bioindustri) ved 37°C.og 5 % CO2.
RNA blev ekstraheret fra 1 × 107 trophozoiter i 1 ml TRIzol-reagens (Vazyme, Nanjing, Kina), genomisk DNA blev ekstraheret fra totalt G. duodenalis RNA ved anvendelse af MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Kina), og komplementært DNA (cDNA) blev syntetiseret ved at bruge MonScript RTIIII Super Mix (Monad) i henhold til producentens instruktioner.
CDS-sekvensinformation for mål-G. duodenalis-genet blev opnået fra NCBI GenBank.Brug Primer 5.0 til at designe specifikke sømløse kloningsprimere for hvert målgen.Den fremadrettede primer (5'-3') består af tre dele: en overlappende sekvens med en lineariseret vektor pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) og startkodonerne ATG og GNN (hvis den første base ikke er G).Dette gøres for at forbedre effektiviteten af ​​udtrykket.Derudover mindst 16 bp kombinerede baser (GC indhold 40–60%/Tm ca. 55 °C).Den omvendte primer (5′-3′) består af to dele, en overlappende sekvens med en EcoRV-lineariseret vektor pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) og en kombineret base på mindst 16 bp.(ekskl. de to sidste stop).baser) et kodon såsom AA eller GA for at tillade rekombinante plasmider at udtrykke deres mærkede proteiner).Primersekvenserne er anført i tabel 1 og blev syntetiseret af Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Kina).
Mål blev amplificeret under anvendelse af Pfu DNA-polymerase (Tiangen, Beijing, Kina) eller Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, Kina) under anvendelse af fremstillet G. duodenalis cDNA som skabelon.Det eukaryote ekspressionsvektorplasmid pcDNA3.1(+) blev lineariseret med restriktionsenzym EcoRV og dephosphoryleret under anvendelse af Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Lineariserede pcDNA3.1(+)-fragmenter og amplificerede målgenfragmenter blev oprenset ved hjælp af et DNA-geloprensningskit (Tiangen) og kvantificeret ved anvendelse af en Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).pcDNA3.1(+)-fragmentet og hvert målgenfragment blev rekombineret under anvendelse af MonClone enkeltsamlingskloningsblanding (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Kina) og bekræftet ved DNA-sekventering under anvendelse af Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Kina)..
Endotoxin-fri plasmider pcDNA3.1(+)-alpha-2 og pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 blev genereret under anvendelse af SanPrep Endotoxin-fri Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech).Koncentrationen blev holdt over 500 ng/µl for at sikre, at EDTA i elueringsbufferen ikke interfererede med transfektionsassayet.Primære muse peritoneale makrofager blev dyrket i 6-brøndsplader med komplet RPMI 1640 medium (Biological Industries) i 12 timer, derefter blev cellerne vasket 3 gange i varm PBS for at fjerne penicillin og streptomycin og derefter i medium suppleret med komplet medium.Endotoksinfrie plasmider pcDNA3.1(+)-alpha-2 og pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2,5 μg) blev fortyndet i 125 μl Opti-MEM reduceret serummedium (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Derefter blev 5 µl Lipofectamine 2000 transfektionsreagens (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) fortyndet i 125 µl lavserum Opti-MEM-medium.Forbered liposom-DNA-komplekser ved at blande det fortyndede endotoksinfri plasmid med Lipofectamine 2000 og lade blandingen stå ved stuetemperatur i 5 minutter.Overfør komplekserne separat til celler i hver brønd og bland langsomt.Efter 4 timer blev cellekulturmediet erstattet med 2 ml komplet RPMI 1640-medium, og dyrkning blev fortsat i 24 timer.Frisk cellekulturmedium blev tilsat til cellerne og inkuberet i forskellige tidspunkter afhængigt af assaydesignet.
Proteinprøver fra supernatanter og cellelysater blev fremstillet som beskrevet tidligere [25].Membranoverførselsparametre for pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actin og His-tag var 200 mA/90 min.For interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), caspase-1 (p20) (Adipogen, Schweiz) og NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Schweiz) og 1:5000 rettet mod His tag (Amylet Scientific, Wuhan, Kina) og β-actin (Proteintech, Wuhan, Kina).
Tværbinding med disuccinimidsuberat (DSS) blev udført som beskrevet tidligere [26].Celler blev vasket 3 gange med kold PBS og fuldstændig lyseret med en 27 gauge nål i 50 µl ASC-reaktionsbuffer (pH 8,0) indeholdende 25 mM Na2P04, 187,5 mM NaCI, 25 mM HEPES og 125 mM NaHC03.Blandingen blev centrifugeret ved 5000 g i 3 minutter, og pelleten blev syet med 10 µl DSS (25 mM i DMSO) og 40 µl ASC-reaktionsbuffer i 30 minutter ved 37°C.Efter centrifugering ved 5000 g i 10 minutter blev pelleten opløst i en opløsning af 40 µl ASC-reaktionsbuffer og 10 µl 6x proteinpåfyldningsbuffer (TransGen, Beijing, Kina), og derefter blev opløsningen standset ved stuetemperatur i 15 min., Kog derefter 10 minutter.Proteinprøver blev derefter udsat for Western blotting under anvendelse af primære anti-ASC-antistoffer (Wanleibio, Shenyang, Kina) ved et fortyndingsforhold på 1:500.
Efter en tidligere beskrevet procedure [13] blev cellekultursupernatanter høstet, og sekretion af det pro-inflammatoriske cytokin IL-1β blev bestemt ved anvendelse af muse IL-1 Beta ELISA kit (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Konverter OD450nm-værdier til proteinkoncentrationer ved hjælp af IL-1β-standardkurven.
Celler coatet på dækglas blev forsigtigt vasket 3 gange i varm PBS, fikseret i vævscellefiksativ (Biosharp, Beijing, Kina) i 10 minutter ved stuetemperatur (RT), i 0,1 % Triton X-Permeabilize ved 100 (fortyndet i PBS; Biosharp) ) i 20 minutter ved stuetemperatur og bloker i 5 % bovint serumalbumin (i PBS) i 2 timer ved stuetemperatur.Celler blev derefter inkuberet natten over ved 4°C med primære antistoffer mod henholdsvis ASC (1:100 fortynding) eller NLRP3 (1:100 fortynding) og Cy3-mærket gede-anti-kanin IgG(H+L) (1:400; EarthOx) , San Francisco, CA, USA) eller FITC-konjugeret gede-anti-muse-IgG (1:400; Earthox) natten over ved 37°C i mørke i 1 time.Kernerne blev farvet med Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, Kina) i 5 minutter og observeret under et fluorescensmikroskop (Olympus Corporation, Tokyo, Japan).
Mus blev opdelt i fire grupper (n = 7 i hver gruppe): (i) PBS-behandlet negativ kontrolgruppe (kun PBS; sonde 100 µl/muse PBS efterfulgt af daglig intraperitoneal injektion 100 µl/mus PBS 3 timer senere).kontinuerligt i 7 dage);(ii) negativ kontrolgruppe behandlet med MCC950-hæmmer [27] (100 µl/mus via PBS sonde, 3 timer senere, 10 mg/kg legemsvægt [BW] MCC950 [i PBS] blev administreret intraperitonealt dagligt, varighed 7 dage);(iii) G. duodenalis cysteinfektionsgruppe (1,5 x 106 cyster/mus ved sondemad, 3 timer senere, 100 μl/mus PBS intraperitonealt administreret dagligt i 7 dage);(iv) G. duodenalis cyste kombineret infektionsgruppe MCC950-hæmmerbehandlingsgruppe (1,5 x 106 cyster/mus via sonde, 10 mg/kg legemsvægt MCC950 intraperitonealt dagligt i 7 dage efter 3 timer).Legemsvægten af ​​hver mus blev overvåget dagligt, og alle mus blev aflivet på den 7. dag.Høstet duodenum (3 cm lang) blev skåret i små stykker i 1 ml PBS, cyster blev ødelagt natten over i PBS ved 4°C, og G. duodenalis trophozoites.Frisk duodenum (1 cm lang) blev isoleret for hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning.
Mus blev opdelt i to grupper: (i) MOCK-kontrolgruppe og (ii) MCC950-hæmmergruppe.Der var fem behandlinger i hver gruppe (n = 7/behandlingsgruppe): (i) PBS-behandling negativ kontrolgruppe (kun PBS; 100 µl/mus PBS, intramuskulær (IM) injektion (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) plasmid negativ kontrolgruppe (100 µg/muse-DNA, via intramuskulær injektion) (iii) G. duodenalis cysteinfektion positiv kontrolgruppe (1,5 x 106 cyster/mus, via sonde) (iv) a); gruppe behandlet med plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 μg/muse-DNA, ved intramuskulær injektion), og (v) en gruppe behandlet med plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 µg/mus) DNA, efter 12 timers passage, modtog mus i MCC950-hæmmergruppen en daglig intraperitoneal injektion af MCC950 (10 mg/kg kropsvægt) i 7 dage, mens mus i MOCK-gruppen modtog et lige så stort volumen PBS-behandling. Blodprøver blev opsamlet fra øjeæblemusene og efterladt natten over ved 4 °C. Serumprøver blev isoleret under anvendelse af enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) for og målinger af IL-1β-niveauer.
Femogtredive mus blev opdelt i fem grupper (n=7/gruppe).Gruppe 1 var en negativ kontrolgruppe behandlet med PBS: mus modtog 100 μl PBS intramuskulært og 3 dage senere med sonde.Gruppe 2 er en positiv kontrolgruppe inficeret med G. duodenalis-cyster: mus blev injiceret med 100 μl PBS, og 3 dage senere blev 1,5 x 106 cyster/mus injiceret intragastrisk.Tredje gruppe – plasmidimmunisering med pcDNA3.1(+) i kombination med en kontrolgruppe for duodenal cysteinfektion: mus modtog 100 μg plasmid-DNA pcDNA3.1(+)(im) oralt, 1,5×106 cyster/mus 3 for flere dage.Gruppe 4 og 5 var rekombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2-giardinplasmid eller pcDNA3.1(+)-alpha-7.3-giardinplasmid i kombination med G. duodenalis-cysteinfektion.Eksperimentel gruppe: mus modtog 100 µg pcDNA3.1(+)-giardin-plasmid-DNA (im), derefter 3 dage senere blev 1,5 x 106 cyster/mus injiceret via sonde.Legemsvægten af ​​hver mus blev overvåget efter indføringen af ​​G. duodenalis-cysten gennem røret.Frisk duodenum blev indsamlet til parasitbelastningsmålinger og HE-farvningsanalyse.
Histopatologiske ændringer blev analyseret i henhold til en tidligere offentliggjort procedure [30].Frisk duodenum blev fikseret med vævscellefiksativ, indlejret i paraffin, skåret i 4 μm sektioner, farvet med H&E og analyseret under et lysmikroskop.Repræsentative patologiske ændringer i syv vævssnit fra syv uafhængige mus blev evalueret af en patolog, der ikke var klar over behandlingen, og blev fanget ved 200x forstørrelse.Længden af ​​villi og dybden af ​​krypterne blev målt i overensstemmelse med de tidligere beskrevne metoder.
Resultaterne in vitro og in vivo blev opnået i tre eksemplarer.Grafer blev genereret ved hjælp af GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).Forskelle mellem to grupper blev analyseret ved t-test, mens forskelle mellem ≥3 grupper blev analyseret ved en-vejs variansanalyse (ANOVA) ved brug af SPSS-software (version 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA).Data blev analyseret for varianshomogenitet ved brug af Levene's test efterfulgt af Bonferronis post hoc test (B).Signifikans er udtrykt som P<0,05, P<0,01 og P<0,001 (ikke signifikant [ns]) (P>0,05).
Vores tidligere analyse af GEV-proteomik i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) viste, at mange mål kan være involveret i aktiveringen af ​​inflammatoriske signalveje [13].Vi udvalgte to lovende mål, alpha-2 og alpha-7.3 giardiner, amplificerer disse molekyler og bruger dem til at konstruere den pcDNA3.1(+) eukaryote ekspressionsvektor.Efter sekventering blev rekombinante pcDNA3.1(+)-alpha-2 og alpha-7.3 giardine ekspressionsplasmider transficeret ind i primære muse peritoneale makrofager, og caspase-1 p20 signaturproteinet for inflammation (et fragment af aktiveret caspase-1) blev identificeret som belysning af nøglemolekyler, der kan udløse betændelse.Resultaterne viste, at alpha-2 og alpha-7.3 giardiner kan inducere p20 caspase-1 ekspression svarende til GEV.Ingen effekt på caspase-1-aktivering blev fundet i den ubehandlede negative kontrol (kun PBS) og plasmidkontrol pcDNA3.1(+) (figur 1).
Måling af p20 caspase-1 aktivering ved hjælp af pcDNA3.1(+)-alpha-2 og alpha-7.3 giardiner.Rekombinante eukaryote ekspressionsplasmider pcDNA3.1(+)-alpha-2 og alpha-7.3 giardiner (over hver bane) blev transficeret ind i primære muse peritoneale makrofager, og kultursupernatanter blev høstet 24 timer senere.Western blotting blev brugt til at måle ekspressionsniveauer af signatur caspase-1 p20 inflammasomproteinet.Den eneste PBS-behandlingsgruppe (bane C) og pcDNA3.1(+) monoterapigruppen (pcDNA3.1-bane) blev brugt som en negativ kontrol, og GEV-behandlingsgruppen blev brugt som en positiv kontrol.Ekspression af det rekombinante protein blev bekræftet ved at detektere et histidinmærke i hvert protein, og de forventede proteinbånd var alfa-2-giardin (38,2 kDa) og alfa-7,3-giardin (37,2 kDa).GEV, Giardia duodenum ekstracellulære vesikler, pcDNA3.1(+), EcoRV-lineariseret vektor, SUP, supernatant
For at bestemme, om alpha-2-giardin og alpha-7.3-giardin inducerer p20-caspase-1-ekspression og spiller en rolle i aktivering af værtens NLRP3-inflammatoriske respons, pcDNA3.1(+)-alpha-2-giardin og pcDNA3.1(+)-alpha -7.3 giardin blev transficeret ind i primære muse peritoneale makrofager med rekombinant plasmid DNA, og niveauer af ekspression, lokalisering og oligomerisering af de inflammatoriske nøgleproteiner NLRP3 blev bestemt.I dette eksperiment blev GEV anvendt som den positive kontrolgruppe, og gruppen uden behandling (kun PBS) eller pcDNA3.1(+) transfektionsbehandlingsgruppen var den negative gruppe.Resultaterne viste, at som i GEV-gruppen resulterede rekombinant plasmid-DNA af giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 og giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 i opregulering af NLRP3, pro-IL-1β og procaspase-1 og caspase-1 aktivering (fig. 2a).Derudover inducerede begge giardiner signifikant IL-1β-sekretion (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; alfa-2-giardin: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007 ).;alfa-7,3-giardin: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (figur 2b).De fleste ASC-proteiner var monomere i gruppen uden behandling eller i behandlingsgruppen transficeret med pcDNA3.1(+)-plasmidet i modsætning til pcDNA3.1(+)-alpha-2 eller pcDNA3.1(+)-alpha- 7,3 giardine.ASC-oligomerisering forekom i det rekombinante plasmid-DNA fra den GEV-positive kontrolgruppe eller gruppe, hvilket viste en oligomer form (figur 2c).Disse foreløbige data tyder på, at alfa-2-giardin og alfa-7,3-giardin kan inducere NLRP3-inflammationsaktivering.Efterfølgende immunfluorescerende undersøgelser af lokaliseringen af ​​ASC og NLRP3 viste, at i den negative kontrolgruppe var ASC-proteinet spredt over hele cytoplasmaet og fremkom som et priksignal ved stimulering af pcDNA3.1(+)-alpha-2 med giardin eller pcDNA3.1(+)-alfa-7,3-giardingruppe eller GEV-positiv kontrolgruppe (figur 2d).I de negative kontrol- og plasmid-behandlede pcDNA 3.1-grupper blev NLRP3-proteinsignalet ikke detekteret, mens en fluorescerende signalprik som reaktion på pcDNA3.1(+)-alpha-2-giardin eller pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 blev opdaget..giardin findes i cytoplasmaet eller ved stimulering af HEV (fig. 2e).Disse data viser yderligere, at G. duodenalis giardin alpha-2 og giardin alpha-7.3 aktiverer NLRP3-inflammasomet i primære peritoneale musemakrofager.
pcDNA3.1(+)-alpha-2-giardin og pcDNA3.1(+)-alpha-7.3-giardin aktiverer NLRP3-inflammasomet i peritoneale musemakrofager.Transficer de rekombinante eukaryote ekspressionsplasmider pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin og pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin ind i primære murine peritoneale makrofager og celler, eller høst supernatanten inden for 24 timer til analyse af ekspression, oligomerisering , sekretion.og lokalisering af centrale inflammatoriske proteiner.PBS-kun (C)-gruppen og pcDNA3.1(+)-enkeltbehandlingsgruppen blev brugt som den negative kontrol, og GEV-behandlingsgruppen blev brugt som den positive gruppe.a Nøgleinflammatoriske proteiner NLRP3, herunder NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1 og p20 caspase-1, blev påvist ved Western blotting.b Niveauerne af sekretion af IL-1β i supernatanterne blev bestemt ved anvendelse af enzym-linked immunosorbent assay (ELISA).Forskelle mellem kontrol- og eksperimentelle grupper blev analyseret ved en-vejs variansanalyse (ANOVA) ved brug af SPSS-softwareversion 22.0.Stjerner indikerer signifikante forskelle mellem grupperne **P<0,01 og ***P<0,001.c ASC-oligomeriseringsniveauer i pellets blev bestemt ved DSS-tværbindingsanalyse, mens ASC-niveauer i cellelysater blev brugt som en ladningskontrol.d Visualisering af ISC-lokalisering ved hjælp af immunfluorescens.e Immunfluorescens blev brugt til at visualisere lokaliseringen af ​​NLRP3.ASC, apoptotisk pletterlignende protein;IL, interleukin;NLRP3, nukleotidbindende oligomeriseringslignende receptor 3;ns, ikke signifikant (P > 0,05)
Både G. duodenalis og de GEV'er, den udskiller, aktiverer NLRP3-inflammasomet og regulerer værtens inflammatoriske reaktioner in vitro.Således forbliver NLRP3-inflammasomets rolle i patogeniciteten af ​​G. duodenalis uklar.For at undersøge dette problem designede vi et eksperiment mellem mus inficeret med G. duodenalis-cyste og mus inficeret med G. duodenalis-cyste + MCC950-hæmmerbehandling og sammenlignede NLRP3-inflammasomekspression, når de var inficeret med G. duodenalis-cyste.Et detaljeret skema for eksperimentet er vist i fig. 3a.Ændringer i kropsvægt af mus i forskellige behandlingsgrupper blev overvåget i 7 dage efter infektion med cyster, og resultaterne er vist i fig. 3b.Sammenlignet med gruppen behandlet med ren PBS viste resultaterne, at (i) kropsvægten af ​​mus inficeret med G. duodenalis cyste faldt fra dag 3 til dag 7 efter infektion;(ii) behandling med MCC950-hæmmeren havde ingen signifikant effekt på musenes kropsvægt..Sammenlignet med enkeltinfektionsgruppen faldt BW i duodenalinfektionsgruppen behandlet med MCC950 i varierende grad (Dag 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; Dag 2: ANOVA, F(3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001; Dag 3: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010; (3, 24)=0,6497, P=0,0645;Disse data viser, at NLRP3-inflammasomet beskytter mus mod betydeligt vægttab i de tidlige stadier (2-4 dage) af duodenal infektion.Vi sigtede derefter på at påvise G. duodenalis trophozoiter i duodenal lavagevæske, og resultaterne er vist i figur 3c.Sammenlignet med G. duodenalis-cysteinfektionsgruppen steg antallet af trophozoiter i duodenum signifikant efter blokering af NLRP3-inflammasomet (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Duodenalt væv farvet med HE viste sammenlignet med negativ kontrol behandlet med PBS og MCC950 alene: (i) G. duodenalis cysteinfektion resulterede i beskadigelse af duodenal villi (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P= 0,0488 ) og kryptatrofi (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) duodenum fra mus inficeret med G. duodenalis-cyster og behandlet med MCC950-hæmmere.duodenal villi var beskadiget og døde (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) med atrofi og kryptforgrening (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (Fig. 3d- f) .Disse resultater tyder på, at NLRP3-inflammasomet spiller en rolle i at reducere patogeniciteten af ​​G. duodenalis.
Rolle af NLRP3 inflammasom i Giardia duodenum infektion.Mus blev givet (iv) med duodenokokcyster og derefter behandlet med eller uden MCC950 (ip).Enkeltbehandlingsgrupper med PBS eller MCC950 blev anvendt som kontroller.Eksperimentel gruppe og behandlingsregime.b Kropsvægten af ​​mus i hver af de forskellige behandlingsgrupper blev overvåget i 7 dage.Forskellen mellem G. duodenalis-infektionsgruppen og G. duodenalis + MCC950-infektionsbehandlingsgruppen blev analyseret ved t-test ved brug af SPSS-softwareversion 22.0.Stjerner indikerer signifikante forskelle ved *P<0,05, **P<0,01 eller ***P<0,001.c Parasitisk belastning blev bestemt ved at tælle antallet af trophozoiter i duodenal lavagevæske.Forskellen mellem G. duodenalis-infektionsgruppen og G. duodenalis + MCC950-infektionsbehandlingsgruppen blev analyseret ved t-test ved brug af SPSS-softwareversion 22.0.Stjerner indikerer signifikante forskelle ved *P < 0,05.d Hæmatoxylin og eosin (H&E) farvningsresultater af duodenal histopatologi.Røde pile angiver skade på villi, grønne pile angiver skade på krypterne.Målestok: 100 µm.e, f Statistisk analyse af duodenal villus højde og musekryptens højde.Stjerner indikerer signifikante forskelle ved *P<0,05 og **P<0,01.Resultaterne er taget fra 7 uafhængige biologiske forsøg.BW, kropsvægt;ig, intragastrisk leveringsvej;ip, intraperitoneal leveringsvej;ns, ikke signifikant (P > 0,05);PBS, phosphatbufret saltvand;WT, vildtype
Sekretionen af ​​IL-1β er et kendetegn for inflammationsaktivering.For at bestemme om G. duodenalis alpha-2-giardin og alpha-7.3-giardin aktiverer NLRP3-værtsinflammasomet in vivo, brugte vi ubehandlede WT-mus (sham-gruppe) og NLRP3-inflammasom-blokerede mus (MCC950-hæmmet behandlingsgruppe).Et detaljeret skema for eksperimentet er vist i fig. 4a.Eksperimentelle grupper bestod af mus behandlet med PBS, G. duodenalis cystebehandling med sonde, intramuskulær injektion af pcDNA3.1 og intramuskulær injektion af pcDNA3.1(+)-alpha-2-giardin eller pcDNA3.1-alpha-7.3-giardin.På den 7. dag efter intramuskulær administration af det rekombinante plasmid blev serum opsamlet, og niveauet af IL-1β i hver gruppe blev bestemt.Som vist i figur 4b, i MOCK-gruppen: (i) sammenlignet med PBS-gruppen havde pcDNA3.1-behandling ingen signifikant effekt på IL-1β-sekretion (ANOVA, F(4,29)=4,062, P=0,9998). IL-β-sekretion var signifikant forhøjet i G. duodenalis-cystegruppen (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2-giardin og pcDNA3.1- Intramuskulær injektion af alfa-7.3-giardin øgede signifikant serum-IL-1β-niveauer (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3-giardin inducerede høje niveauer af IL-1β-sekretion i pcDNA3.1-alpha-2-giardin-intramuskulære injektionsgruppen (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .Sammenlignet med hver gruppe i MCC950-behandlingsgruppen og MOCK-gruppen: (i) IL-1β-sekretionsniveauer i PBS-kontrolgruppen og pcDNA3.1-kontrolgruppen faldt til en vis grad efter blokering af MCC950-hæmmeren, men forskellen var ikke signifikant (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3,1: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) efter blokering af MCC950.IL-1β-sekretion blev signifikant reduceret i den G. duodenalis-cyste-inficerede gruppe, pcDNA3.1-alpha-2-giardin-gruppen og pcDNA3.1-alpha-7.3-giardin-gruppen (G. duodenalis: ANOVA, F(9) , 58) = 3,540, P = 0,0120; ) = 3,540, P = 0,0164).Disse resultater tyder på, at alpha-2-giardin og alpha-7.3-giardin medierer aktiveringen af ​​NLRP3-inflammasomet in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardiner aktiverer NLRP3-værtsinflammasomet in vivo.Mus blev immuniseret (IM) med rekombinant eukaryotisk ekspressionsplasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2-giardin eller pcDNA3.1(+)-alpha-7.3-giardin og derefter behandlet med MCC950 (ip; MCC950-gruppe) eller ej (dummy-gruppe) ).PBS- eller pcDNA3.1(+)-plasmidbehandlingsgruppen blev anvendt som en negativ kontrol, G. duodenalis cystebehandlingsgruppen blev anvendt som en positiv kontrol.Eksperimentel gruppe og behandlingsregime.b Serumniveauer af IL-1β i mus blev målt på dag 7 ved ELISA-assay.Forskelle mellem grupper i MOCK-gruppen blev analyseret ved hjælp af envejs ANOVA, og forskelle mellem MOCK-gruppen og MCC950-gruppen blev analyseret ved hjælp af t-testen af ​​SPSS-softwareversion 22.0.Stjerner indikerer signifikante forskelle mellem behandlingsgrupper i MOCK-gruppen, *P<0,05 og ***P<0,001;dollartegn ($) indikerer signifikante forskelle mellem hver gruppe i MOCK-gruppen og MCC950-gruppen ved P<0,05.Resultater af syv uafhængige biologiske eksperimenter.i, intramuskulær injektion, ns, ikke signifikant (P > 0,05)
For at undersøge virkningen af ​​alpha-2 og alpha-7.3 giardin-medieret aktivering af NLRP3-værtsinflammasomet på G. duodenalis infektivitet, brugte vi WT C57BL/6-mus og injicerede alpha-2-giardin og alpha-7.3-giardin.plasmidet blev injiceret intramuskulært efter 3 dage gennem mavesonden på G. duodenalis cysten, hvorefter musene blev observeret i 7 dage.Et detaljeret skema over eksperimentet er vist i fig. 5a.Legemsvægten af ​​hver mus blev målt hver dag, prøver af frisk duodenalt væv blev opsamlet på den 7. dag efter administration gennem et mavesonde, antallet af trophozoiter blev målt, og histopatologiske ændringer blev observeret.Som vist i figur 5b, med stigende fodringstid, steg BW af mus i hver gruppe gradvist.MT for mus begyndte at falde på den 3. dag efter intragastrisk administration af G. duodenalis-cyster og steg derefter gradvist.Aktivering af NLRP3-inflammasomet induceret ved intramuskulær injektion af alfa-2-giardin og alpha7.3-giardin svækkede væsentligt vægttab hos mus (dag 1: pcDNA3.1-alpha-2-giardin, ANOVA, F(4, 30) = 1,399, P = 0,9754 Dag 1: pcDNA3.1-alpha-7.3-giardin, ANOVA, F(4, 30)=1,399, P=0,9987 Dag 2: pcDNA3.1-alpha-2-giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,9979; 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Dag 3: pcDNA3.1-alfa-7.3-giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083. Dag 4: pcDNA3.1-alpha-2-giardin , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, dag 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, dag 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Dag 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Dag 61: pcDNA3. alfa-2-giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, dag 6: pcDNA3.1-alpha-7.3-giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Dag 7: pcDNA3.1-alpha-2-giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 Dag 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).Den parasitære belastning blev vurderet i duodenum (fig. 5c).Sammenlignet med den ubehandlede positive kontrol og gruppen injiceret med den tomme pcDNA3.1 vektor, var antallet af G. duodenalis trophozoiter signifikant reduceret i grupperne injiceret med α-2 giardin og α-7,3 giardin (pcDNA3.1-alpha) -2-giardin: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3,1-alfa-7,3-giardin: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Derudover var giardine alfa-7,3 mere beskyttende hos mus end giardine alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).Resultaterne af HE-farvning er vist i fig.5d–f.Mus injiceret med alpha-2 giardine og alpha-7.3 giardine havde færre duodenale vævslæsioner, manifesteret ved villusskade sammenlignet med mus injiceret med G. duodenalis og mus injiceret med G. duodenalis i kombination med en tom pcDNA3 vektor .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2-giardin: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 eller P = 0,0068; pcDNA3.1-alpha-7,3-giardin: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 eller P = 0,0055) og reduceret kryptatrofi (pcDNA3.1-alpha-2-giardin: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 eller P = 0,0158; pcDNA3.1-alpha-7,3 giardin: ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 eller P = 0,0191).Disse resultater tyder på, at alfa-2-giardin og alfa-7,3-giardin reducerer infektiviteten af ​​G. duodenalis ved at aktivere NLRP3-inflammasomet in vivo.
Rolle af pcDNA3.1(+)-giardiner i G. duodenalis infektion.Mus blev immuniseret (IM) med rekombinante eukaryote ekspressionsplasmider pcDNA3.1(+)-alpha-2-giardin eller pcDNA3.1(+)-alpha-7.3-giardin og derefter udfordret med G. duodenalis-cyster (ig).PBS-gruppen og pcDNA3.1(+) + duodenal cyste-behandlingsgruppen blev brugt som negative kontrolgrupper, og duodenal cyste-behandlingsgruppen blev brugt som positiv kontrolgruppe.Eksperimentel gruppe og behandlingsregime.b MT af mus i hver af de forskellige behandlingsgrupper blev overvåget i 7 dage efter udfordring.Stjerner indikerer signifikante forskelle mellem grupper i G. duodenalis-gruppen og pcDNA3.1(+)-alpha-2-giardingruppen, *P < 0,05, **P < 0,01 og ***P < 0,001;dollartegnet ($) angiver en signifikant forskel mellem hver gruppe af G. duodenalis og pcDNA3.1(+)-alpha-7.3-jardingruppen, $$P<0,01 og $$$P<0,001.c Parasitisk belastning blev bestemt ved at tælle antallet af trophozoiter i 1 ml duodenal lavage fra duodenum (3 cm lang) og udtrykt som antallet af parasitter pr. cm duodenum.Forskelle mellem G. duodenalis-infektionsgruppen, pcDNA3.1(+)-alpha-2-giardingruppen og pcDNA3.1(+)-alpha-7.3-giardingruppen blev analyseret ved envejs ANOVA ved brug af SPSS-softwareversion 22.0.Stjerner indikerer signifikante forskelle ved **P<0,01 og ***P<0,001.d Histopatologiske forandringer i tolvfingertarmen.Røde pile angiver skade på villi, grønne pile angiver skade på krypterne.Målestok: 100 µm.e, f Statistisk analyse af mus duodenal villus højde (e) og krypt højde (f).Forskelle mellem grupperne i figur 1d blev analyseret ved en-vejs ANOVA ved hjælp af SPSS-softwareversion 22.0.Stjerner indikerer signifikante forskelle ved *P<0,05 og **P<0,01.Resultater af syv uafhængige biologiske eksperimenter.ns, ikke signifikant (P > 0,05)
Giardia duodenum er en velkendt tarmparasit hos mennesker og andre pattedyr, der forårsager giardiasis.I 2004 blev det inkluderet i WHO's initiativ til forsømte sygdomme på grund af dets høje udbredelse over 6 år, især i samfund med lav socioøkonomisk status [32].Det medfødte immunsystem spiller en kritisk rolle i immunresponset på G. duodenalis-infektion.Musemakrofager er blevet rapporteret at opsluge og dræbe G. duodenalis ved at frigive ekstracellulære fælder [33].Vores tidligere undersøgelser har vist, at G. duodenalis, en ikke-invasiv ekstracellulær parasit, aktiverer p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 og NLRP3 inflammatoriske signalveje i musemakrofager for at regulere værtens inflammatoriske reaktioner, og frigivet GEV kan forbedre denne proces.13], 24].De nøjagtige PAMP'er involveret i NLRP3-inflammasom-reguleret inflammation i GEV og rollen af ​​NLRP3-inflammasom i giardiasis mangler dog at blive belyst.For at belyse disse to spørgsmål har vi gennemført denne undersøgelse.
NLRP3-inflammasomet er placeret i immuncellernes cytoplasma og kan aktiveres af forskellige partikler såsom urinsyrekrystaller, toksiner, bakterier, vira og parasitter.I bakterielle undersøgelser er toksiner blevet identificeret som nøgle PAMP'er, der aktiverer inflammatoriske sensorer, hvilket fører til inflammation og celledød [34].Nogle strukturelt forskellige toksiner, såsom hæmolysin fra Staphylococcus aureus [35] og Escherichia coli [36], hæmolysin BL (HBL) fra enterotoksin (NHE) [37], inducerer aktiveringen af ​​NLRP3-inflammation.Virale undersøgelser har vist, at virulensproteiner såsom SARS-COV-2-kappe (E)-protein [38] og Zika-virus NS5-protein [39] er vigtige PAMP'er, der genkendes af NLRP3-receptoren.I parasitundersøgelser er mange parasitter blevet rapporteret at være forbundet med værtsinflammasomaktivering, såsom Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] og Leishmania [42].De tætte granulatproteiner GRA35, GRA42 og GRA43, forbundet med virulensen af ​​Toxoplasma gondii, er nødvendige for induktion af pyroptose i Lewis-rottemakrofager [43].Derudover har nogle Leishmania-undersøgelser fokuseret på individuelle molekyler involveret i NLRP3-inflammasomet, såsom parasitmembranlipophosphoglycan [44] eller zinkmetalloprotease [45].Blandt den annexin-lignende alpha-giardin-familie af gener har alpha-1-giardin vist sig at være en potentiel vaccinekandidat, der giver beskyttelse mod G. duodenalis i en musemodel [18].I vores undersøgelse valgte vi G. duodenalis virulensfaktorer alpha-2 og alpha-7,3 giardiner, som er unikke for giardia, men relativt mindre rapporterede.Disse to målgener blev klonet ind i den pcDNA3.1(+) eukaryote ekspressionssystemvektor til analyse af inflammationsaktivering.
I vores musemodel tjener spaltede caspasefragmenter som markører for inflammatorisk aktivering.Ved stimulering interagerer NLRP3 med ASC, rekrutterer procaspaser og genererer aktive caspaser, der spalter pro-IL-1β og pro-IL-18 til henholdsvis moden IL-1β og IL-18.Inflammatoriske caspaser (caspaser-1, -4, -5 og -11) er en konserveret familie af cysteinproteaser, der er kritiske for medfødt forsvar og er involveret i inflammation og programmeret celledød [46].Caspase-1 aktiveres af kanoniske inflammasomer [47], mens caspase-4, -5 og -11 spaltes under dannelsen af ​​atypiske inflammasomer [48].I denne undersøgelse brugte vi muse peritoneale makrofager som en model og undersøgte p20 caspase-1 spaltet caspase-1 som en markør for vært NLRP3 inflammationsaktivering i undersøgelser af G. duodenalis infektion.Resultaterne viste, at mange alfa-giardiner er ansvarlige for den typiske aktivering af inflammation, hvilket er i overensstemmelse med opdagelsen af ​​vigtige virulensmolekyler involveret i bakterier og vira.Vores undersøgelse er dog kun en foreløbig screening, og der er andre molekyler, der kan aktivere ikke-klassiske inflammasomer, da vores tidligere undersøgelse fandt både klassiske og ikke-klassiske inflammasomer ved G. duodenalis-infektion [13].For yderligere at bestemme, om den genererede p20 caspase-1 er associeret med NLRP3-inflammasomet, transficerede vi alpha-2 og alpha-7.3 giardiner ind i muse peritoneale makrofager for at bestemme nøglemolekyleproteinekspressionsniveauer og ASC-oligomeriseringsniveauer, hvilket bekræfter, at begge a-giardiner aktiverer inflammasom NLRP3.Vores resultater er lidt forskellige fra dem fra Manko-Prykhoda et al., der rapporterede, at stimulering af Caco-2-celler med G. muris eller E. coli EPEC-stammer alene kan øge fluorescensintensiteten af ​​NLRP3, ASC og caspase-1, selvom ikke signifikant, mens hvordan costimulering af G. muris og E. coli øgede niveauerne af tre proteiner [49].Denne uoverensstemmelse kan skyldes forskelle i udvælgelsen af ​​Giardia-arter, cellelinjer og primære celler.Vi udførte også in vivo assays med MCC950 i 5 uger gamle WT C57BL/6 hunmus, som er mere modtagelige for G. duodenalis.MCC950 er en potent og selektiv NLRP3-hæmmer med lille molekyle, der blokerer kanonisk og ikke-kanonisk NLRP3-aktivering ved nanomolære koncentrationer.MCC950 hæmmer NLRP3-aktivering, men påvirker ikke aktiveringen af ​​AIM2-, NLRC4- og NLRP1-inflammatoriske veje eller TLR-signalveje [27].MCC950 blokerer NLRP3-aktivering, men hæmmer ikke NLRP3-initiering, K+-udstrømning, Ca2+-tilstrømning eller interaktionen mellem NLRP3 og ASC;i stedet hæmmer det NLRP3-inflammasomaktivering ved at blokere ASC-oligomerisering [27].Derfor brugte vi MCC950 i en in vivo-undersøgelse for at bestemme rollen for NLRP3-inflammasomet efter giardin-injektion.Aktiveret caspase-1 p10 spalter pro-inflammatoriske cytokiner pro-IL-1β og pro-IL-18 til moden IL-1β og IL-18 [50].I denne undersøgelse blev serum-IL-1β-niveauer i giardin-behandlede mus med eller uden MCC950 brugt som en indikator for, om NLRP3-inflammasomet var aktiveret.Som forventet reducerede MCC950-behandling signifikant serum-IL-1β-niveauer.Disse data viser klart, at G. duodenalis giardin alfa-2 og giardin alfa-7.3 er i stand til at aktivere NLRP3-museinflammasomet.
Væsentlige data akkumuleret i løbet af det sidste årti har vist, at IL-17A er hovedregulatoren af ​​immunitet mod G. muris, der inducerer IL-17RA-signalering, producerer antimikrobielle peptider og regulerer komplementaktivering [51].Giardia-infektion forekommer dog hyppigere hos unge voksne, og det er blevet rapporteret, at Giardia-infektion hos unge mus ikke aktiverer IL-17A-responset for at udøve sin beskyttende virkning [52], hvilket får forskerne til at lede efter andre immunmodulerende Giardia.mekanismer for helminth-infektion.Forfatterne af en nylig undersøgelse rapporterede, at G. muris kan aktivere NLRP3-inflammasomet af E. coli EPEC, som fremmer produktionen af ​​antimikrobielle peptider og reducerer dets tilknytningskapacitet og antallet af trophozoitter i tarmkanalen, og derved reducerer sværhedsgraden af ​​tyktarmen. sygdomme forårsaget af baciller [49].NLRP3-inflammasomet er involveret i udviklingen af ​​forskellige sygdomme.Undersøgelser har vist, at Pseudomonas aeruginosa udløser autofagi i makrofager for at undgå celledød, og denne proces afhænger af aktiveringen af ​​NLRP3-inflammasomet [53].For N. caninum begrænser reaktiv oxygenart-medieret aktivering af NLRP3-inflammasomet dets replikation i værten, hvilket gør det til et potentielt terapeutisk mål [9].Paracoccidioides brasiliensis har vist sig at inducere aktiveringen af ​​NLRP3-inflammasomet i museknoglemarvs-afledte dendritiske celler, hvilket resulterer i frigivelsen af ​​det inflammatoriske cytokin IL-1β, som spiller en kritisk rolle i værtsforsvaret [10].Adskillige Leishmania-arter, herunder L. amazonensis, L. major, L. braziliensis og L. infantum chagasi, aktiverer NLRP3 og ASC-afhængig caspase-1 i makrofager, såvel som Leishmania-infektion.Parasitreplikation forstærkes hos mus, der mangler NLRP3/ASC/caspase-1-genet [11].Zamboni et al.Leishmania-infektion er blevet rapporteret at inducere aktivering af NLRP3-inflammasomet i makrofager, hvilket begrænser intracellulær parasitreplikation.Leishmania kan således hæmme NLRP3-aktivering som en undgåelsesstrategi.I in vivo undersøgelser bidrog NLRP3-inflammasomet til elimineringen af ​​Leishmania, men påvirkede ikke væv [54].Omvendt undertrykte aktivering af NLRP3-inflammasomet i helminthiasis-undersøgelser værtens beskyttende immunitet mod gastrointestinal helminthiasis [12].Shigella er en af ​​de vigtigste bakterier, der forårsager diarré på verdensplan.Disse bakterier kan inducere IL-1β-produktion gennem P2X7-receptor-medieret K+ efflux, reaktive oxygenarter, lysosomal forsuring og mitokondriel skade.NLRP3-inflammasomet regulerer negativt fagocytose og bakteriedræbende aktivitet af makrofager mod Shigella [55].Plasmodium undersøgelser har vist, at mus med AIM2, NLRP3 eller caspase-1 mangel inficeret med Plasmodium producerer høje niveauer af type 1 interferon og er mere modstandsdygtige over for Plasmodium infektion [56].Imidlertid er alpha-2-giardins og alpha-7.3-giardins rolle i at inducere patogen aktivering af NLRP3-inflammation hos mus uklar.
I denne undersøgelse reducerede inhibering af NLRP3-inflammasomet af MCC950 BW og øgede antallet af trophozoiter i tarmskylningsvæske hos mus, hvilket resulterede i mere alvorlige patologiske ændringer i duodenalt væv.Alfa-2-giardin og alfa-7.3-giardin aktiverer værtsmusens NLRP3-inflammasom, øger musens kropsvægt, reducerer antallet af trophozoiter i tarmskylningsvæske og lindrer patologiske duodenale læsioner.Disse resultater tyder på, at G. duodenalis kan aktivere NLRP3-værtsinflammasomet via alfa-2-giardin og alpha-7,3-giardin, hvilket reducerer patogeniciteten af ​​G. duodenalis hos mus.
Samlet viser vores resultater, at alfa-2- og alfa-7.3-giardiner inducerer aktiveringen af ​​NLRP3-værtsinflammasomet og reducerer infektiviteten af ​​G. duodenalis hos mus.Derfor er disse molekyler lovende mål til forebyggelse af giardiasis.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: et overblik.Det blev for nylig afsløret, at Pat Inflamm er allergisk over for stoffer.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: en gennemgang af farmakoterapi.Ekspertudtalelse fra en farmaceut.2007;8: 1885-902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, lægemiddelresistens og opdagelsen af ​​nye mål.Inficerer Disord-lægemiddelmål.2010;10:295-302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T osv. NLRP3 inflammasom og inflammatoriske sygdomme.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Inflammasomets rolle i tarmbetændelse og cancer.Gastroenterologi.2011;141:1986-99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Kanonisk og atypisk NLRP3-inflammasomaktivering i krydsfeltet mellem immuntolerance og tarmbetændelse.præ-immun.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.ROS-medieret NLRP3-inflammasomaktivering er involveret som reaktion på N. caninum-infektion.Parasit vektor.2020;13:449.