Tak fordi du besøgte Nature.com.Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse.For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer).I mellemtiden, for at sikre fortsat support, vil vi gengive webstedet uden stilarter og JavaScript.
Toxoplasma gondii er en intracellulær protozo-parasit, der modulerer mikromiljøet af den inficerede vært og vides at være forbundet med forekomsten af ​​hjernetumorvækst.I denne undersøgelse antager vi, at exosomal miRNA-21 fra Toxoplasma-infektion fremmer hjernetumorvækst.Exosomer fra Toxoplasma-inficerede BV2-mikroglia blev karakteriseret, og internalisering af U87-gliomceller blev bekræftet.Eksosomale mikroRNA-ekspressionsprofiler blev analyseret ved hjælp af arrays af microRNA og microRNA-21A-5p forbundet med Toxoplasma gondii og tumorsortering.Vi undersøgte også mRNA-niveauerne af tumorassocierede gener i U87-gliomceller ved at ændre miR-21-niveauer i exosomer og effekten af ​​exosomer på human U87-gliomcelleproliferation.I exosomer af U87-gliomceller inficeret med Toxoplasma gondii øges ekspressionen af ​​microRNA-21, og aktiviteten af ​​antitumorgener (FoxO1, PTEN og PDCD4) reduceres.BV2-afledte exosomer inficeret med Toxoplasma inducerer proliferation af U87 gliomceller.Exosomer inducerer vækst af U87-celler i en musetumormodel.Vi foreslår, at øget exosomal miR-21 i Toxoplasma-inficerede BV2-mikroglia kan spille en vigtig rolle som en cellevækstfremmer i U87-gliomceller ved at nedregulere antitumorgener.
Det anslås, at mere end 18,1 millioner tilfælde af fremskreden cancer blev diagnosticeret på verdensplan i 2018, med omkring 297.000 tumorer i centralnervesystemet diagnosticeret hvert år (1,6 % af alle tumorer)1.Tidligere forskning har vist, at risikofaktorer for udvikling af menneskelige hjernetumorer omfatter forskellige kemiske produkter, familiehistorie og ioniserende stråling fra hovedterapeutisk og diagnostisk udstyr.Den nøjagtige årsag til disse maligne sygdomme er dog ukendt.Cirka 20 % af alle kræfttilfælde på verdensplan er forårsaget af smitsomme stoffer, herunder vira, bakterier og parasitter3,4.Infektiøse patogener forstyrrer værtscellens genetiske mekanismer, såsom DNA-reparation og cellecyklus, og kan føre til kronisk inflammation og skader på immunsystemet5.
Infektiøse agenser forbundet med human cancer er de mest almindelige virale patogener, herunder humane papillomavirus og hepatitis B- og C-vira.Parasitter kan også spille en potentiel rolle i udviklingen af ​​kræft hos mennesker.Adskillige parasitarter, nemlig Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis og Hymenolepis nana, er blevet impliceret i forskellige typer af human cancer 6,7,8.
Toxoplasma gondii er en intracellulær protozo, der regulerer mikromiljøet i inficerede værtsceller.Denne parasit anslås at inficere cirka 30% af verdens befolkning, hvilket bringer hele befolkningen i fare9,10.Toxoplasma gondii kan inficere vitale organer, herunder centralnervesystemet (CNS), og forårsage alvorlige sygdomme som fatal meningitis og encephalitis, især hos immunkompromitterede patienter9.Toxoplasma gondii kan dog også ændre miljøet for den inficerede vært ved at modulere cellevækst og immunrespons hos immunkompetente individer, hvilket fører til opretholdelse af en asymptomatisk kronisk infektion9,11.Interessant nok, givet korrelationen mellem T. gondii-prævalens og hjernetumorforekomst, tyder nogle rapporter på, at in vivo værtsmiljøændringer på grund af kronisk T. gondii-infektion ligner tumormikromiljøet.
Exosomer er kendt som intercellulære kommunikatorer, der leverer biologisk indhold, herunder proteiner og nukleinsyrer, fra naboceller16,17.Exosomer kan påvirke tumorrelaterede biologiske processer såsom anti-apoptose, angiogenese og metastaser i tumormikromiljøet.Især miRNA'er (miRNA'er), små ikke-kodende RNA'er med en længde på ca. 22 nukleotider, er vigtige post-transkriptionelle genregulatorer, der kontrollerer mere end 30% af humant mRNA gennem det miRNA-inducerede lyddæmpningskompleks (miRISC).Toxoplasma gondii kan forstyrre biologiske processer ved at kontrollere miRNA-ekspression i inficerede værter.Værts miRNA'er indeholder vigtige signaler til regulering af værtens biologiske processer for at opnå parasittens overlevelsesstrategi.At studere ændringer i værtens miRNA-profil efter infektion med T. gondii kan således hjælpe os med at forstå interaktionen mellem værten og T. gondii mere klart.Thirugnanam et al.15 foreslog, at T. gondii fremmer hjernecarcinogenese ved at ændre dets udtryk på specifikke værts miRNA'er forbundet med tumorvækst og fandt ud af, at T. gondii kan forårsage gliomer i forsøgsdyr.
Denne undersøgelse fokuserer på ændringen af ​​exosomal miR-21 i værtsmikroglia inficeret med Toxoplasma BV2.Vi observerede en mulig rolle af ændret exosomal miR-21 i væksten af ​​U87 gliomceller på grund af retentionen i kernen af ​​FoxO1/p27, som er målet for overudtrykt miR-21.
Exosomer afledt af BV2 blev opnået ved hjælp af differentiel centrifugering og valideret ved forskellige metoder for at forhindre kontaminering med cellulære komponenter eller andre vesikler.SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) viste tydelige mønstre mellem proteiner ekstraheret fra BV2-celler og exosomer (figur 1A), og prøver blev vurderet for tilstedeværelsen af ​​Alix, som blev analyseret ved Western blotting af exosomale proteinmarkører i .Alix-mærkning blev fundet i exosomproteiner, men ikke i BV2-cellelysatproteiner (fig. 1B).Desuden blev oprenset RNA fra exosomer afledt af BV2 analyseret under anvendelse af en bioanalyzer.18S og 28S ribosomale underenheder blev sjældent observeret i det exosomale RNA-migreringsmønster, hvilket indikerer pålidelig renhed (figur 1C).Endelig viste transmissionselektronmikroskopi, at de observerede exosomer var omkring 60-150 nm i størrelse og havde en koplignende struktur typisk for exosommorfologi (fig. 1D).
Karakterisering af exosomer afledt af BV2-celler.(A) Side med sikkerhedsdatablad.Proteiner blev isoleret fra BV2-celler eller exosomer afledt af BV2.Proteinmønstre er forskellige mellem celler og exosomer.(B) Western blot-analyse af en exosomal markør (Alix).(C) Evaluering af oprenset RNA fra BV2-celler og BV2-afledte exosomer ved anvendelse af en bioanalyzer.Således blev 18S og 28S ribosomale underenheder i BV2-celler sjældent fundet i exosomal RNA.(D) Transmissionselektronmikroskopi viste, at exosomer isoleret fra BV2-celler var negativt farvet med 2% uranylacetat.Exosomer er ca. 60-150 nm i størrelse og skålformede (Song og Jung, upublicerede data).
Cellulær internalisering af BV2-afledte exosomer i U87 humane gliomceller blev observeret ved anvendelse af konfokal mikroskopi.PKH26-mærkede exosomer er lokaliseret i cytoplasmaet af U87-celler.Kerner blev farvet med DAPI (fig. 2A), hvilket indikerer, at BV2-afledte exosomer kan internaliseres af værtsceller og påvirke miljøet af modtagerceller.
Internalisering af BV2-afledte exosomer i U87-gliomceller og BV2-afledte exosomer inficeret med Toxoplasma RH inducerede proliferation af U87-gliomceller.(A) Exosomer opslugt af U87-celler målt ved konfokal mikroskopi.U87-gliomceller blev inkuberet med exosomer mærket med PKH26 (rød) eller uden kontrol i 24 timer.Kernerne blev farvet med DAPI (blå) og derefter observeret under et konfokalt mikroskop (skalastang: 10 μm, x 3000).(B) U87-gliomcelleproliferation blev bestemt ved celleproliferationsassay.U87 gliomceller blev behandlet med exosomer i det angivne tidsrum. *P < 0,05 blev opnået ved Students t-test. *P < 0,05 blev opnået ved Students t-test. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0,05 ved Elevens t-test. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 opnået ved hjælp af Students t-test.
Efter at have bekræftet internaliseringen af ​​BV2-afledte exosomer i U87-gliomceller udførte vi celleproliferationsassays for at undersøge rollen af ​​BV2-afledte Toxoplasma-afledte exosomer i udviklingen af ​​humane gliomceller.Behandling af U87-celler med exosomer fra T. gondii-inficerede BV2-celler viste, at T. gondii-inficerede BV2-afledte exosomer forårsagede signifikant højere proliferation af U87-celler sammenlignet med kontrol (fig. 2B).
Derudover havde vækst af U118-celler de samme resultater som U87, da Toxoplasma-stimulerede exosomer forårsagede de højeste niveauer af proliferation (data ikke vist).Baseret på disse data kan vi indikere, at BV2-afledte Toxoplasma-inficerede exosomer spiller en vigtig rolle i gliomcelleproliferation.
For at undersøge effekten af ​​Toxoplasma-inficerede BV2-afledte exosomer på tumorudvikling injicerede vi U87-gliomceller i nøgne mus til en xenograft-model og injicerede BV2-afledte exosomer eller RH-inficerede BV2-afledte exosomer.Efter at tumorer blev tydelige efter 1 uge, blev hver forsøgsgruppe på 5 mus opdelt efter tumorstørrelse for at bestemme det samme udgangspunkt, og tumorstørrelse blev målt i 22 dage.
Hos mus med U87 xenograft-modellen blev signifikant større tumorstørrelse og vægt observeret i den BV2-afledte RH-inficerede exosomgruppe på dag 22 (fig. 3A,B).På den anden side var der ingen signifikant forskel i tumorstørrelse mellem den BV2-afledte exosomgruppe og kontrolgruppen efter exosombehandling.Desuden viste mus injiceret med gliomceller og exosomer visuelt det største tumorvolumen i gruppen af ​​RH-inficerede BV2-afledte exosomer (fig. 3C).Disse resultater viser, at BV2-afledte Toxoplasma-inficerede exosomer inducerer gliomvækst i en musetumormodel.
Onkogenese (AC) af BV2-afledte exosomer i en U87 xenograft musemodel.Tumorstørrelse (A) og vægt (B) blev signifikant forøget i BALB/c nøgne mus behandlet med RH-inficerede exosomer afledt af BV2.BALB/c nøgne mus (C) blev injiceret subkutant med 1 x 107 U87-celler suspenderet i Matrigel-blanding.Seks dage efter injektion blev 100 μg BV2-afledte exosomer behandlet i mus.Tumorstørrelse og vægt blev målt på henholdsvis de angivne dage og efter aflivning. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05.
Dataene viste, at 37 miRNA'er (16 overudtrykte og 21 nedudtrykte) forbundet med immunitet eller tumorudvikling blev signifikant ændret i mikroglia efter infektion med Toxoplasma RH-stammen (fig. 4A).Relative ekspressionsniveauer af miR-21 blandt ændrede miRNA'er blev bekræftet af real-time RT-PCR i exosomer afledt af BV2, exosomer behandlet med BV2 og U87 celler.Ekspression af miR-21 viste en signifikant stigning i exosomer fra BV2-celler inficeret med Toxoplasma gondii (RH-stamme) (fig. 4B).Relative ekspressionsniveauer af miR-21 i BV2- og U87-celler steg efter optagelse af ændrede exosomer (fig. 4B).De relative niveauer af miR-21-ekspression i hjernevævet hos tumorpatienter og mus inficeret med Toxoplasma gondii (ME49-stamme) var henholdsvis højere end i kontroller (fig. 4C).Disse resultater korrelerer med forskelle mellem ekspressionsniveauerne af forudsagte og bekræftede mikroRNA'er in vitro og in vivo.
Ændringer i ekspressionen af ​​exosomal miP-21a-5p i mikroglia inficeret med Toxoplasma gondii (RH).(A) Demonstrerer signifikante ændringer i siRNA forbundet med immunitet eller tumorudvikling efter T. gondii RH-infektion.(B) Relative miR-21-ekspressionsniveauer blev detekteret ved realtids-RT-PCR i BV2-afledte exosomer, BV2-behandlede exosomer og U87-celler.(C) Relative miR-21-ekspressionsniveauer blev fundet i hjernevævet hos tumorpatienter (N=3) og mus inficeret med Toxoplasma gondii (ME49-stamme) (N=3). *P < 0,05 blev opnået ved Students t-test. *P < 0,05 blev opnået ved Students t-test. *P < 0,05 til at betale med t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 blev opnået under anvendelse af Students t-test. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 opnået ved hjælp af Students t-test.
Exosomer fra RH-inficerede BV2-celler førte til vækst af gliomer in vivo og in vitro (fig. 2, 3).For at påvise relevante mRNA'er undersøgte vi mRNA-niveauer af antitumor-målgener, forkhead box O1 (FoxO1), PTEN og programmeret celledød 4 (PDCD4) i U87-celler inficeret med exosomer afledt af BV2 eller RH BV2.Bioinformatikanalyse har vist, at flere tumorassocierede gener, herunder FoxO1-, PTEN- og PDCD4-generne, har miR-2121,22-bindingssteder.mRNA-niveauer af antitumormålgener blev reduceret i RH-inficerede BV2-afledte exosomer sammenlignet med BV2-afledte exosomer (fig. 5A).FoxO1 viste reducerede proteinniveauer i RH-inficerede BV2-afledte exosomer sammenlignet med BV2-afledte exosomer (figur 5B).Baseret på disse resultater kunne vi bekræfte, at exosomer afledt af RH-inficeret BV2 nedregulerer anti-onkogene gener og bevarer deres rolle i tumorvækst.
Toxoplasma RH-inficerede BV2-afledte exosomer inducerer suppression af antitumorgener i U87-gliomceller af Toxoplasma RH-inficerede BV2-afledte exosomer.(A) Real-time PCR af FoxO1, PTEN og PDCD4 ekspression i exosomer afledt af T. gondii RH-inficeret BV2 sammenlignet med PBS exosomer.β-actin-mRNA blev anvendt som kontrol.(B) FoxO1-ekspression blev bestemt ved Western blotting, og densitometridata blev statistisk evalueret ved hjælp af ImageJ-programmet. *P < 0,05 blev opnået ved Students t-test. *P < 0,05 blev opnået ved Students t-test. *P < 0,05 til at betale med t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 blev opnået under anvendelse af Students t-test. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 opnået ved hjælp af Students t-test.
For at forstå effekten af ​​miP-21 i exosomer på tumorassocieret genregulering blev U87-celler transficeret med en inhibitor af miP-21 under anvendelse af Lipofectamine 2000, og cellerne blev høstet 24 timer efter transfektion.FoxO1- og p27-ekspressionsniveauer i celler transficeret med miR-21-hæmmere blev sammenlignet med celler behandlet med BV2-afledte exosomer ved hjælp af qRT-PCR (fig. 6A,B).Transfektion af miR-21-hæmmeren ind i U87-celler nedregulerede FoxO1- og p27-ekspression signifikant (FIG. 6).
RH-inficeret exosomal BV2-afledt miP-21 ændrede FoxO1/p27-ekspression i U87-gliomceller.U87-celler blev transficeret med miP-21-inhibitor under anvendelse af Lipofectamine 2000, og celler blev høstet 24 timer efter transfektion.FoxO1- og p27-ekspressionsniveauer i celler transficeret med miR-21-hæmmere blev sammenlignet med niveauer i celler behandlet med BV2-afledte exosomer ved hjælp af qRT-PCR (A, B).
For at undslippe værtens immunrespons forvandles Toxoplasma-parasitten til en vævscyste.De parasiterer forskellige væv, herunder hjernen, hjertet og skeletmuskulaturen, gennem hele værtens levetid og modulerer værtens immunrespons.Derudover kan de regulere cellecyklussen og apoptose af værtsceller, hvilket fremmer deres spredning14,24.Toxoplasma gondii inficerer overvejende værtsdendritiske celler, neutrofiler og monocyt/makrofager-slægt, herunder hjernemikroglia.Toxoplasma gondii inducerer differentieringen af ​​makrofager af M2-fænotypen, påvirker sårheling efter patogeninfektion og er også forbundet med hypervaskularisering og granulomatøs fibrose.Denne adfærdsmæssige patogenese af Toxoplasma-infektion kan være relateret til markører forbundet med tumorudvikling.Det fjendtlige miljø reguleret af Toxoplasma kan ligne den tilsvarende præcancer.Derfor kan det antages, at Toxoplasma-infektion skal bidrage til udviklingen af ​​hjernetumorer.Faktisk er høje forekomster af Toxoplasma-infektion blevet rapporteret i serum fra patienter med forskellige hjernetumorer.Derudover kan Toxoplasma gondii være en anden kræftfremkaldende effektor og virke synergistisk for at hjælpe andre infektiøse kræftfremkaldende stoffer med at udvikle hjernetumorer.I denne forbindelse er det værd at bemærke, at P. falciparum og Epstein-Barr-virus synergistisk bidrager til dannelsen af ​​Burkitts lymfom.
Exosomes rolle som regulatorer inden for kræftforskning er blevet grundigt undersøgt.Eksosomernes rolle mellem parasitter og inficerede værter er dog stadig dårligt forstået.Indtil videre har forskellige regulatorer, herunder udskilte proteiner, forklaret de biologiske processer, hvorved protozoiske parasitter modstår værtsangreb og fastholder infektion.For nylig har der været et voksende koncept, at protozo-associerede mikrovesikler og deres mikroRNA'er interagerer med værtsceller for at skabe et gunstigt miljø for deres overlevelse.Derfor er yderligere undersøgelser nødvendige for at opdage forholdet mellem ændrede exosomale miRNA'er og gliomcelleproliferation.MikroRNA-ændring (klyngegener miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 og miR-17-92) binder til STAT3-promotoren i toxoplasma-inficerede humane makrofager, reguleres og inducerer anti -apoptose som reaktion på Toxoplasma gondii-infektion 29.Toxoplasmainfektion øger ekspressionen af ​​miR-17-5p og miR-106b-5p, som er forbundet med adskillige hyperproliferative sygdomme 30 .Disse data tyder på, at værts miRNA'er reguleret af Toxoplasma-infektion er vigtige molekyler for parasitoverlevelse og patogenese i værts biologiske adfærd.
Ændrede miRNA'er kan påvirke forskellige typer adfærd under initiering og progression af maligne celler, herunder gliomer: selvforsyning af vækstsignaler, ufølsomhed over for væksthæmmende signaler, apoptoseunddragelse, ubegrænset replikativt potentiale, angiogenese, invasion og metastaser og inflammation.I gliom er ændrede miRNA'er blevet identificeret i flere ekspressionsprofileringsundersøgelser.
I denne undersøgelse bekræftede vi høje niveauer af miRNA-21-ekspression i toxoplasma-inficerede værtsceller.miR-21 er blevet identificeret som en af ​​de hyppigst overudtrykte mikroRNA'er i solide tumorer, herunder gliomer, 33 og dets ekspression korrelerer med graden af ​​gliom.Akkumulerende beviser tyder på, at miR-21 er et nyt onkogen, der fungerer som en anti-apoptotisk faktor i gliomvækst og er stærkt overudtrykt i væv og plasma af humane hjernekræftsygdomme.Interessant nok udløser miR-21-inaktivering i gliomceller og -væv inhiberingen af ​​celleproliferation på grund af caspase-afhængig apoptose.Bioinformatisk analyse af forudsagte miR-21-mål afslørede flere tumorsuppressorgener forbundet med apoptoseveje, herunder programmeret celledød 4 (PDCD4), tropomyosin (TPM1), PTEN og forkheadbox O1 (FoxO1) med miR-2121-bindingsstedet..22.38.
FoxO1, som en af ​​transkriptionsfaktorerne (FoxO), er involveret i udviklingen af ​​forskellige typer af human cancer og kan regulere ekspressionen af ​​tumorsuppressorgener såsom p21, p27, Bim og FasL40.FoxO1 kan binde og aktivere cellecyklushæmmere såsom p27 for at undertrykke cellevækst.Desuden er FoxO1 en nøgleeffektor af PI3K/Akt-signalering og regulerer mange biologiske processer såsom cellecyklusprogression og celledifferentiering gennem aktivering af p2742-transkription.
Som konklusion mener vi, at exosomal miR-21 afledt af Toxoplasma-inficerede mikroglia kan spille en vigtig rolle som vækstregulator af gliomceller (fig. 7).Yderligere undersøgelser er imidlertid nødvendige for at finde en direkte sammenhæng mellem exosomal miR-21, ændret Toxoplasma-infektion og gliomvækst.Disse resultater forventes at give et udgangspunkt for at studere sammenhængen mellem Toxoplasma-infektion og forekomsten af ​​gliom.
Et skematisk diagram af mekanismen for gliom (hjerne) carcinogenese er foreslået i denne undersøgelse.Forfatteren tegner i PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Alle eksperimentelle protokoller i denne undersøgelse, inklusive brugen af ​​dyr, var i overensstemmelse med Seoul National University Animal Care and User Committee Standard Ethical Guidelines og blev godkendt af Institutional Review Board for Seoul National University School of Medicine (IRB-nummer SNU- 150715).-2).Alle eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med ARRIVE anbefalinger.
BV2 muse mikroglia og U87 humane gliomceller blev dyrket i henholdsvis Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) og Roswell Park Memorial Institute's Medium (RPMI; Welgene), hver indeholdende 10% føtalt bovint serum, 4 mM l- glutamin, 0,2 mM penicillin og 0,05 mM streptomycin.Celler blev dyrket i en inkubator med 5% CO2 ved 37°C.En anden gliomcellelinje, U118, blev anvendt til sammenligning med U87-celler.
For at isolere exosomer fra T. gondii-inficerede RH- og ME49-stammer blev T. gondii-tachyzoiter (RH-stamme) høstet fra bughulen på 6 uger gamle BALB/c-mus injiceret 3-4 dage før.Tachyzoitter blev vasket tre gange med PBS og oprenset ved centrifugering i 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.For at opnå tachyzoitter af stamme ME49 blev BALB/c-mus injiceret intraperitonealt med 20 vævscyster, og tachyzoittransformation i cyster blev opsamlet ved at vaske bughulen på den 6.-8. dag efter infektion (PI).Mus inficeret med PBS.ME49-tachyzoitter blev dyrket i celler suppleret med 100 μg/ml penicillin (Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA), 100 μg/ml streptomycin (Gibco/BRL) og 5% føtalt bovint serum (Lonza, Walkersville, MD) .., USA) ved 37 °C og 5 % kuldioxid.Efter dyrkning i Vero-celler blev ME49-tachyzoitter ført to gange gennem en 25 gauge nål og derefter gennem et 5 µm filter for at fjerne affald og celler.Efter vask blev tachyzoitterne resuspenderet i PBS44.Vævscyster af Toxoplasma gondii stamme ME49 blev vedligeholdt ved intraperitoneal injektion af cyster isoleret fra hjernen af ​​inficerede C57BL/6 mus (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).Hjernerne fra ME49-inficerede mus blev høstet efter 3 måneders PI og hakket under et mikroskop for at isolere cyster.De inficerede mus blev holdt under særlige patogenfrie forhold (SPF) på Seoul National University School of Medicine.
Total RNA blev ekstraheret fra BV2-afledte exosomer, BV2-celler og væv ved hjælp af miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til producentens instruktioner, inklusive inkubationstiden for elueringstrinnet.RNA-koncentrationen blev bestemt på et NanoDrop 2000 spektrofotometer.Kvaliteten af ​​RNA-mikroarrays blev vurderet ved hjælp af en Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies, Amstelveen, Holland).
DMEM med 10 % exosomfattig FBS blev fremstillet ved ultracentrifugering ved 100.000 g i 16 timer ved 4°C og filtreret gennem et 0,22 µm filter (Nalgene, Rochester, NY, USA).BV2-celler, 5 × 105, blev dyrket i DMEM indeholdende 10% exosom-depleteret FBS og 1% antibiotika ved 37°C og 5% CO2.Efter 24 timers inkubation blev tachyzoitter af stamme RH eller ME49 (MOI = 10) tilsat til cellerne, og ikke-invaderende parasitter blev fjernet inden for en time og genopfyldt med DMEM.Exosomer fra BV2-celler blev isoleret ved modificeret differentiel centrifugering, den mest udbredte metode.Resuspender exosompelleten i 300 µl PBS til RNA- eller proteinanalyse.Koncentrationen af ​​isolerede exosomer blev bestemt under anvendelse af et BCA-proteinassay-kit (Pierce, Rockford, IL, USA) og et NanoDrop 2000 spektrofotometer.
Præcipitater fra BV2-celler eller exosomer afledt af BV2 blev lyseret i PRO-PREP™-proteinekstraktionsopløsning (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea), og proteiner blev fyldt på Coomassie brilliant blue-farvede 10% SDS polyacrylamidgeler.Derudover blev proteiner overført til PVDF-membraner i 2 timer.Western blots blev valideret under anvendelse af Alix-antistoffet (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) som en exosomal markør.HRP-konjugeret gede-anti-muse IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) og en LAS-1000 plus luminescerende billedanalysator (Fuji Photographic Film, Tokyo, Japan) blev brugt som et sekundært antistof..Transmissionselektronmikroskopi blev udført for at studere størrelsen og morfologien af ​​exosomer.Exosomer isoleret fra BV2-celler (6,40 µg/µl) blev fremstillet på carbon-coatede masker og negativt farvet med 2% uranylacetat i 1 min.De forberedte prøver blev observeret ved en accelererende spænding på 80 kV under anvendelse af en JEOL 1200-EX II (Tokyo, Japan) udstyret med et ES1000W Erlangshen CCD-kamera (Gatan, Pleasanton, CA, USA).
BV2-afledte exosomer blev farvet under anvendelse af PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i 15 minutter ved stuetemperatur.U87-celler, 2×105, med PKH26-mærkede exosomer (røde) eller ingen exosomer som negativ kontrol, blev inkuberet ved 37°C i 24 timer i en 5% CO2-inkubator.U87-cellekerner blev farvet med DAPI (blå), U87-celler blev fikseret i 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved 4°C og derefter analyseret i et Leica TCS SP8 STED CW konfokalmikroskopsystem (Leica Microsystems, Mannheim, Tyskland).observerbar.
cDNA blev syntetiseret fra siRNA under anvendelse af Mir-X siRNA første streng syntese og SYBR qRT-PCR kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japan).Kvantitativ PCR i realtid blev udført ved hjælp af iQ5 realtids-PCR-detektionssystem (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ved hjælp af primere og skabeloner blandet med SYBR Premix.DNA blev amplificeret i 40 cyklusser af denaturering ved 95°C i 15 s og annealing ved 60°C i 60 s.Dataene fra hver PCR-reaktion blev analyseret ved hjælp af dataanalysemodulet i iQ™5 optiske systemsoftware (Bio-Rad).Relative ændringer i genekspression mellem udvalgte målgener og β-actin/siRNA (og U6) blev beregnet ved hjælp af standardkurvemetoden.De anvendte primersekvenser er vist i tabel 1.
3 x 104 U87 gliomceller blev podet i plader med 96 brønde og blandet med Toxoplasma-inficerede exosomer afledt af BV2 (50 μg/mL) eller ikke-pulse exosomer afledt af BV2 (50 μg/mL) som kontroller efter 12, 18 og 36 timer. .Celleproliferationshastigheden blev bestemt under anvendelse af Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) (Supplerende figurer S1-S3) 46 .
5 uger gamle BALB/c nøgne hunmus blev købt fra Orient Bio (Seongnam-si, Sydkorea) og holdt individuelt i sterile bure ved stuetemperatur (22±2°C) og fugtighed (45±15°C).%) ved stuetemperatur (22±2°C) og luftfugtighed (45±15%).En 12-timers lyscyklus og en 12-timers mørkecyklus blev udført under SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center).Mus blev tilfældigt opdelt i tre grupper på 5 mus hver, og alle grupper blev injiceret subkutant med 400 ml PBS indeholdende 1 x 107 U87 gliomceller og vækstfaktor reduceret BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, USA).Seks dage efter tumorinjektion blev 200 mg exosomer afledt af BV2-celler (med/uden Toxoplasma-infektion) injiceret i tumorstedet.Toogtyve dage efter tumorinfektion blev tumorstørrelsen af ​​mus i hver gruppe målt med en skydelære tre gange om ugen, og tumorvolumenet blev beregnet med formlen: 0,5×(bredde)×2×længde.
MicroRNA-ekspressionsanalyse ved hjælp af miRCURYTM LNA miRNA-array, 7. generation har mmu- og rno-arrays (EXIQON, Vedbæk, Danmark), der dækker 1119 velkarakteriserede mus blandt 3100 humane, muse- og rotte-miRNA-indfangningsprober.Under denne procedure blev 250 til 1000 ng totalt RNA fjernet fra 5'-phosphatet ved behandling med kalve intestinal alkalisk phosphatase efterfulgt af mærkning med Hy3 grønt fluorescerende farvestof.De mærkede prøver blev derefter hybridiseret ved at indlæse mikroarray-objektglas under anvendelse af et hybridiseringskammerkit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) og et hybridiseringsglassæt (Agilent Technologies).Hybridisering blev udført i 16 timer ved 56°C, derefter blev mikroarrayerne vasket i overensstemmelse med producentens anbefalinger.De behandlede mikroarray-objektglas blev derefter scannet ved hjælp af et Agilent G2565CA microarray-scannersystem (Agilent Technologies).Scannede billeder blev importeret ved hjælp af Agilent Feature Extraction-softwareversion 10.7.3.1 (Agilent Technologies), og fluorescensintensiteten af ​​hvert billede blev kvantificeret ved hjælp af den tilsvarende GAL-fil i den modificerede Exiqon-protokol.Microarray-data for den aktuelle undersøgelse er deponeret i GEO-databasen under adgangsnummer GPL32397.
Ekspressionsprofiler af modne exosomal miRNA'er i mikroglia af RH- eller ME49-stammer inficeret med Toxoplasma blev analyseret ved hjælp af forskellige netværksværktøjer.miRNA'er forbundet med tumorudvikling blev identificeret ved hjælp af miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) og filtreret fra med normaliseret signalintensitet (log2) større end 8,0.Blandt miRNA'er blev differentielt udtrykte miRNA'er fundet at være mere end 1,5 gange ændret ved filteranalyse af miRNA'er ændret af RH- eller ME49-stammer inficeret med T. gondii.
Celler blev podet i plader med seks brønde (3 x 105 celler/brønd) i opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).De transficerede celler blev dyrket i 6 timer, og derefter blev mediet ændret til frisk komplet medium.Celler blev høstet 24 timer efter transfektion.
Statistisk analyse blev hovedsageligt udført ved hjælp af Students t-test med Excel-software (Microsoft, Washington, DC, USA).Til eksperimentel dyreanalyse blev en to-vejs ANOVA udført under anvendelse af Prism 3.0 software (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). P-værdier < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikante. P-værdier < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikante. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P-værdier <0,05 blev betragtet som statistisk signifikante. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P-værdier <0,05 blev betragtet som statistisk signifikante.
Alle eksperimentelle protokoller brugt i denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board fra Seoul National University School of Medicine (IRB nummer SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Estimeret global cancerforekomst og dødelighed i 2018: GLOBOCAN kilder og metoder.Fortolkning.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Et indblik i risikofaktorerne for hjernetumorer og deres terapeutiske indgreb. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Et indblik i risikofaktorerne for hjernetumorer og deres terapeutiske indgreb.Rashid, S., Rehman, K. og Akash, MS En gennemgang af risikofaktorer for hjernetumorer og større terapeutiske indgreb. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Dyb forståelse af hjernetumorrisikofaktorer og terapeutiske indgreb.Rashid, S., Rehman, K. og Akash, MS En gennemgang af risikofaktorer for hjernetumorer og større terapeutiske indgreb.Biomedicinsk videnskab.Farmaceut.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakteriel-virale interaktioner i humane fordøjelseskanalen og kvindelige kønsorganer: Et resumé af epidemiologiske og laboratoriebeviser. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakteriel-virale interaktioner i humane fordøjelseskanalen og kvindelige kønsorganer: Et resumé af epidemiologiske og laboratoriebeviser.Kato I., Zhang J. og Sun J. Bakterie-virale interaktioner i kræft i den humane mave-tarmkanal og kvindelige kønsorganer: et resumé af epidemiologiske og laboratoriedata. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterio-viral interaktion i menneskelig mundhulefordøjelse og kvindelig reproduktionskanal: resumé af populær sygdomsvidenskab og laboratoriebevis.Kato I., Zhang J. og Sun J. Bakterie-virale interaktioner i human gastrointestinal cancer og kvindelig genital cancer: et resumé af epidemiologiske og laboratoriedata.Cancer 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Fra infektion til cancer: Hvordan DNA-tumorvira ændrer værtscellens centrale kulstof- og lipidmetabolisme. Magon, KL & Parish, JL Fra infektion til cancer: Hvordan DNA-tumorvira ændrer værtscellens centrale kulstof- og lipidmetabolisme.Mahon, KL og Parish, JL Brandinfektion til cancer: hvordan DNA-baserede tumorvira ændrer værtscellens centrale kulstof- og lipidmetabolisme. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢 Magon, KL & Parish, JL Fra infektion til cancer: hvordan DNA-tumorvira ændrer værtscellens centrale kulstof- og lipidmetabolisme.Mahon, KL og Parish, JL Affyrer infektion til kræft: hvordan DNA-tumorvira ændrer central kulstof- og lipidmetabolisme i værtsceller.Åben biologi.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Katekoløstrogener fra schistosomer og leverflåger og helminth-associeret cancer.foran.varmt indeni.5, 444 (2014).