Tak fordi du besøgte Nature.com.Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse.For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer).I mellemtiden, for at sikre fortsat support, vil vi gengive webstedet uden stilarter og JavaScript.
Genvektorer til behandling af pulmonal cystisk fibrose skal målrettes mod de ledende luftveje, da perifer lungetransduktion ikke har nogen terapeutisk effekt.Effektiviteten af ​​viral transduktion er direkte relateret til opholdstiden for bæreren.Imidlertid diffunderer leveringsvæsker, såsom genbærere, naturligt ind i alveolerne under inhalation, og terapeutiske partikler af enhver form fjernes hurtigt ved mucociliær transport.Det er vigtigt, men vanskeligt at opnå, at forlænge opholdstiden for genbærere i luftvejene.Bærerkonjugerede magnetiske partikler, der kan rettes til overfladen af ​​luftvejene, kan forbedre regional målretning.På grund af problemer med in vivo billeddannelse er adfærden af ​​sådanne små magnetiske partikler på luftvejsoverfladen i nærværelse af et påført magnetfelt dårligt forstået.Formålet med denne undersøgelse var at bruge synkrotron-billeddannelse til at visualisere in vivo bevægelsen af ​​en række magnetiske partikler i luftrøret på bedøvede rotter for at studere dynamikken og adfærdsmønstrene for enkelt- og bulkpartikler in vivo.Vi vurderede derefter også, om levering af lentivirale magnetiske partikler i nærvær af et magnetfelt ville øge effektiviteten af ​​transduktion i rotteluftrøret.Synchrotron røntgenbilleddannelse viser magnetiske partiklers opførsel i stationære og bevægelige magnetfelter in vitro og in vivo.Partikler kan ikke nemt trækkes hen over overfladen af ​​levende luftveje ved hjælp af magneter, men under transport koncentreres aflejringer i synsfeltet, hvor magnetfeltet er stærkest.Transduktionseffektiviteten blev også øget seks gange, når lentivirale magnetiske partikler blev leveret i nærvær af et magnetfelt.Tilsammen tyder disse resultater på, at lentivirale magnetiske partikler og magnetiske felter kan være værdifulde tilgange til at forbedre genvektormålretning og transduktionsniveauer i de ledende luftveje in vivo.
Cystisk fibrose (CF) er forårsaget af variationer i et enkelt gen kaldet CF transmembrane conductance regulator (CFTR).CFTR-proteinet er en ionkanal, der er til stede i mange epitelceller i hele kroppen, inklusive luftvejene, et hovedsted i patogenesen af ​​cystisk fibrose.Defekter i CFTR fører til unormal vandtransport, dehydrering af luftvejsoverfladen og nedsat luftvejsoverfladevæskelag (ASL) dybde.Det forringer også mucociliær transport (MCT)-systemets evne til at rense luftvejene for inhalerede partikler og patogener.Vores mål er at udvikle en lentiviral (LV) genterapi for at levere den korrekte kopi af CFTR-genet og forbedre ASL, MCT og lungesundhed, og at fortsætte med at udvikle nye teknologier, der kan måle disse parametre in vivo1.
LV-vektorer er en af ​​de førende kandidater til cystisk fibrose genterapi, primært fordi de permanent kan integrere det terapeutiske gen i luftvejs basalceller (luftvejsstamceller).Dette er vigtigt, fordi de kan genoprette normal hydrering og slimclearance ved at differentiere til funktionelle genkorrigerede luftvejsoverfladeceller forbundet med cystisk fibrose, hvilket resulterer i livslange fordele.LV-vektorer skal rettes mod de ledende luftveje, da det er her, lungepåvirkning af CF begynder.Levering af vektoren dybere ind i lungen kan resultere i alveolær transduktion, men dette har ingen terapeutisk effekt ved cystisk fibrose.Imidlertid migrerer væsker såsom genbærere naturligt ind i alveolerne, når de inhaleres efter fødslen3,4, og terapeutiske partikler udstødes hurtigt ind i mundhulen af ​​MCT'er.Effektiviteten af ​​LV-transduktion er direkte relateret til den tid, vektoren forbliver tæt på målcellerne for at tillade cellulær optagelse – "opholdstid" 5, som let forkortes af typisk regional luftstrøm samt koordineret optagelse af slim og MCT-partikler.For cystisk fibrose er evnen til at forlænge LV-opholdstid i luftvejene vigtig for at opnå høje niveauer af transduktion i dette område, men har hidtil været udfordrende.
For at overvinde denne forhindring foreslår vi, at LV magnetiske partikler (MP'er) kan hjælpe på to komplementære måder.For det første kan de styres af en magnet til luftvejsoverfladen for at forbedre målretningen og hjælpe genbærerpartikler til at være i det rigtige område af luftvejen;og ASL) bevæger sig ind i cellelag 6. MP'er bruges i vid udstrækning som målrettede lægemiddelleveringsbærere, når de binder til antistoffer, kemoterapilægemidler eller andre små molekyler, der binder til cellemembraner eller binder til deres respektive celleoverfladereceptorer og akkumuleres på tumorsteder i tilstedeværelse af statisk elektricitet.Magnetiske felter til cancerterapi 7. Andre "hypertermiske" metoder er rettet mod at dræbe tumorceller ved at opvarme MP'er, når de udsættes for oscillerende magnetfelter.Princippet om magnetisk transfektion, hvor et magnetfelt bruges som et transfektionsmiddel til at øge overførslen af ​​DNA til celler, bruges almindeligvis in vitro ved hjælp af en række ikke-virale og virale genvektorer til vanskelige at transducere cellelinjer ..Effektiviteten af ​​LV-magnetotransfektion med levering af LV MP in vitro ind i en cellelinje af humant bronchial epitel i nærvær af et statisk magnetfelt blev etableret, hvilket øgede effektiviteten af ​​transduktion med 186 gange sammenlignet med LV-vektoren alene.LV MT er også blevet anvendt på en in vitro-model af cystisk fibrose, hvor magnetisk transfektion øgede LV-transduktion i luft-væske-grænsefladekulturer med en faktor 20 i nærvær af cystisk fibrose-sputum10.Imidlertid har in vivo organmagnetotransfektion fået relativt lidt opmærksomhed og er kun blevet evalueret i nogle få dyreforsøg11,12,13,14,15, især i lungerne16,17.Imidlertid er mulighederne for magnetisk transfektion i lungeterapi ved cystisk fibrose klare.Tan et al.(2020) udtalte, at "et valideringsstudie om effektiv pulmonal levering af magnetiske nanopartikler vil bane vejen for fremtidige CFTR-inhalationsstrategier for at forbedre kliniske resultater hos patienter med cystisk fibrose"6.
Opførselen af ​​små magnetiske partikler på overfladen af ​​luftvejene i nærvær af et påført magnetfelt er vanskelig at visualisere og studere, og derfor er de dårligt forstået.I andre undersøgelser har vi udviklet en Synchrotron Propagation Based Phase Contrast X-Ray Imaging (PB-PCXI) metode til ikke-invasiv billeddannelse og kvantificering af minutiøse in vivo ændringer i ASL18 dybde og MCT19 adfærd20 til direkte måling af gaskanal overfladehydrering og bruges som en tidlig indikator for behandlingseffektivitet.Derudover bruger vores MCT-scoringsmetode partikler med en diameter på 10-35 µm sammensat af aluminiumoxid eller glas med højt brydningsindeks som MCT-markører, der er synlige med PB-PCXI21.Begge metoder er velegnede til billeddannelse af en række partikeltyper, herunder MP'er.
På grund af den høje rumlige og tidsmæssige opløsning er vores PB-PCXI-baserede ASL- og MCT-assays velegnede til at studere dynamikken og adfærdsmønstrene for enkelt- og bulkpartikler in vivo for at hjælpe os med at forstå og optimere MP-genleveringsmetoder.Den tilgang, vi bruger her, er baseret på vores undersøgelser ved hjælp af SPring-8 BL20B2 beamline, hvor vi visualiserede væskebevægelse efter levering af en dosis af en dummy-vektor ind i næse- og lungeluftvejene hos mus for at hjælpe med at forklare vores observerede heterogene genekspressionsmønstre i vores gen.dyreforsøg med en bærerdosis på 3,4.
Formålet med denne undersøgelse var at bruge PB-PCXI-synkrotronen til at visualisere in vivo-bevægelser af en række MP'er i luftrøret hos levende rotter.Disse PB-PCXI-billeddannelsesundersøgelser blev designet til at teste MP-serien, magnetfeltstyrke og placering for at bestemme deres effekt på MP-bevægelse.Vi antog, at et eksternt magnetfelt ville hjælpe den leverede MF med at blive eller flytte til målområdet.Disse undersøgelser gav os også mulighed for at bestemme magnetkonfigurationer, der maksimerer mængden af ​​partikler, der er tilbage i luftrøret efter aflejring.I en anden række undersøgelser havde vi til formål at bruge denne optimale konfiguration til at demonstrere transduktionsmønsteret som følge af in vivo levering af LV-MP'er til rotteluftvejene, ud fra den antagelse, at levering af LV-MP'er i forbindelse med luftvejsmålretning ville resultere i i øget LV-transduktionseffektivitet..
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med protokoller godkendt af University of Adelaide (M-2019-060 og M-2020-022) og SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee.Forsøgene blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne fra ARRIVE.
Alle røntgenbilleder blev taget ved BL20XU-strålelinjen ved SPring-8-synkrotronen i Japan ved brug af en opsætning svarende til den tidligere beskrevet21,22.Kort fortalt var forsøgsboksen placeret 245 m fra synkrotronlagerringen.En prøve-til-detektor-afstand på 0,6 m bruges til partikelbilleddannelsesundersøgelser og 0,3 m til in vivo billeddannelsesundersøgelser for at skabe fasekontrasteffekter.En monokromatisk stråle med en energi på 25 keV blev brugt.Billederne blev optaget ved hjælp af en røntgentransducer med høj opløsning (SPring-8 BM3) koblet til en sCMOS-detektor.Transduceren konverterer røntgenstråler til synligt lys ved hjælp af en 10 µm tyk scintillator (Gd3Al2Ga3O12), som derefter ledes til sCMOS-sensoren ved hjælp af et ×10 (NA 0,3) mikroskopobjektiv.sCMOS-detektoren var en Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) med en matrixstørrelse på 2048 × 2048 pixels og en rå pixelstørrelse på 6,5 × 6,5 µm.Denne indstilling giver en effektiv isotrop pixelstørrelse på 0,51 µm og et synsfelt på cirka 1,1 mm × 1,1 mm.Eksponeringsvarigheden på 100 ms blev valgt for at maksimere signal-til-støj-forholdet af magnetiske partikler i og uden for luftvejene, mens bevægelsesartefakter forårsaget af vejrtrækning minimeres.Til in vivo undersøgelser blev en hurtig røntgen-lukker placeret i røntgenvejen for at begrænse strålingsdosis ved at blokere røntgenstrålen mellem eksponeringer.
LV-medier blev ikke brugt i nogen SPring-8 PB-PCXI-billeddannelsesundersøgelser, fordi BL20XU-billeddannelseskammeret ikke er biosikkerhedsniveau 2-certificeret.I stedet valgte vi en række velkarakteriserede parlamentsmedlemmer fra to kommercielle leverandører, der dækker en række størrelser, materialer, jernkoncentrationer og anvendelser – først for at forstå, hvordan magnetiske felter påvirker bevægelsen af ​​parlamentsmedlemmer i glaskapillærer, og derefter i levende luftveje.overflade.Størrelsen af ​​MP varierer fra 0,25 til 18 µm og er lavet af forskellige materialer (se tabel 1), men sammensætningen af ​​hver prøve, inklusive størrelsen af ​​de magnetiske partikler i MP, er ukendt.Baseret på vores omfattende MCT-undersøgelser 19, 20, 21, 23, 24 forventer vi, at MP'er ned til 5 µm kan ses på luftrørets luftvejsoverflade, for eksempel ved at trække på hinanden følgende rammer for at se forbedret synlighed af MP-bevægelse.En enkelt MP på 0,25 µm er mindre end billeddannelsesenhedens opløsning, men PB-PCXI forventes at detektere deres volumetriske kontrast og bevægelsen af ​​overfladevæsken, hvorpå de er aflejret efter at være blevet aflejret.
Prøver for hver MP i tabellen.1 blev fremstillet i 20 μl glaskapillærer (Drummond Microcaps, PA, USA) med en indvendig diameter på 0,63 mm.Corpuskulære partikler er tilgængelige i vand, mens CombiMag-partikler er tilgængelige i producentens proprietære væske.Hvert rør fyldes halvt med væske (ca. 11 µl) og placeres på prøveholderen (se figur 1).Glaskapillærerne blev henholdsvis anbragt vandret på scenen i billedkammeret og placeret ved kanterne af væsken.En 19 mm diameter (28 mm lang) nikkelskalmagnet lavet af sjældne jordarter, neodym, jern og bor (NdFeB) (N35, kat. nr. LM1652, Jaycar Electronics, Australien) med en remanens på 1,17 T blev fastgjort til en separat overførselstabel for at opnå Fjernskift din position under gengivelsen.Røntgenbilleder begynder, når magneten er placeret ca. 30 mm over prøven, og billederne tages med 4 billeder pr. sekund.Under billeddannelsen blev magneten bragt tæt på glaskapillarrøret (i en afstand på ca. 1 mm) og derefter flyttet langs røret for at vurdere effekten af ​​feltstyrke og position.
En in vitro-billeddannelsesopsætning indeholdende MP-prøver i glaskapillærer på stadiet af translation af xy-prøven.Røntgenstrålens bane er markeret med en rød stiplet linje.
Når in vitro synlighed af MP'er var etableret, blev en undergruppe af dem testet in vivo på vildtype hun Wistar albino rotter (~12 uger gamle, ~200 g).Medetomidin 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japan), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) og butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Rotter blev bedøvet med Pharma (Japan) blanding ved intraperitoneal injektion.Efter bedøvelse blev de forberedt til billeddannelse ved at fjerne pelsen omkring luftrøret, indsætte en endotracheal tube (ET; 16 Ga intravenøs kanyle, Terumo BCT) og immobilisere dem i liggende stilling på en specialfremstillet billedplade indeholdende en termopose at opretholde kropstemperaturen.22. Billedpladen blev derefter fastgjort til prøvetrinnet i billedboksen i en lille vinkel for at justere luftrøret vandret på røntgenbilledet som vist i figur 2a.
(a) In vivo-billeddannelsesopsætning i SPring-8-billeddannelsesenheden, røntgenstrålebane markeret med rød stiplet linje.(b, c) Tracheal magnet lokalisering blev udført eksternt ved hjælp af to ortogonalt monterede IP-kameraer.På venstre side af billedet på skærmen kan du se trådløkken, der holder hovedet og leveringskanylen installeret inde i ET-røret.
Et fjernstyret sprøjtepumpesystem (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) under anvendelse af en 100 µl glassprøjte blev forbundet til en PE10-slange (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) under anvendelse af en 30 Ga nål.Marker tuben for at sikre, at spidsen er i den korrekte position i luftrøret, når endotracheal tuben indsættes.Ved hjælp af en mikropumpe blev sprøjtestemplet fjernet, og spidsen af ​​røret blev nedsænket i MP-prøven, der skulle leveres.Det fyldte leveringsrør blev derefter indsat i endotrachealrøret, hvorved spidsen blev placeret på den stærkeste del af vores forventede påførte magnetiske felt.Billedoptagelsen blev kontrolleret ved hjælp af en åndedrætsdetektor forbundet til vores Arduino-baserede timingboks, og alle signaler (f.eks. temperatur, respiration, lukkeråbning/lukning og billedoptagelse) blev optaget ved hjælp af Powerlab og LabChart (AD Instruments, Sydney, Australien) 22 Ved billedbehandling Da huset ikke var tilgængeligt, blev to IP-kameraer (Panasonic BB-SC382) placeret i ca. 90° i forhold til hinanden og brugt til at kontrollere magnetens position i forhold til luftrøret under billeddannelse (Figur 2b, c).For at minimere bevægelsesartefakter blev der taget ét billede pr. vejrtrækning under det terminale respiratoriske flowplateau.
Magneten er fastgjort til det andet trin, som kan være placeret eksternt på ydersiden af ​​billedlegemet.Forskellige positioner og konfigurationer af magneten blev testet, herunder: anbragt i en vinkel på ca. 30° over luftrøret (konfigurationer er vist i figur 2a og 3a);en magnet over dyret og den anden under, med polerne indstillet til tiltrækning (Figur 3b)., en magnet over dyret og en under, med polerne indstillet til frastødning (Figur 3c), og en magnet over og vinkelret på luftrøret (Figur 3d).Efter opsætning af dyret og magneten og indlæsning af MP under test i sprøjtepumpen, aflever en dosis på 50 µl med en hastighed på 4 µl/sek. ved optagelse af billeder.Magneten flyttes derefter frem og tilbage langs eller på tværs af luftrøret, mens den fortsætter med at tage billeder.
Magnetkonfiguration til in vivo billeddannelse (a) en magnet over luftrøret i en vinkel på ca. 30°, (b) to magneter konfigureret til tiltrækning, (c) to magneter konfigureret til frastødning, (d) en magnet over og vinkelret på luftrør.Observatøren kiggede ned fra munden til lungerne gennem luftrøret, og røntgenstrålen passerede gennem venstre side af rotten og forlod højre side.Magneten bevæges enten langs luftvejen eller til venstre og højre over luftrøret i retning af røntgenstrålen.
Vi søgte også at bestemme synligheden og adfærden af ​​partikler i luftvejene i fravær af blanding af respiration og hjertefrekvens.Derfor, i slutningen af ​​billeddannelsesperioden, blev dyrene aflivet humant på grund af overdosis af pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip).Nogle dyr blev efterladt på billeddannelsesplatformen, og efter ophør af vejrtrækning og hjerteslag blev billeddannelsesprocessen gentaget, og der blev tilføjet en ekstra dosis MP, hvis der ikke var nogen MP synlig på luftvejsoverfladen.
De resulterende billeder blev korrigeret for fladt og mørkt felt og derefter samlet til en film (20 billeder i sekundet; 15-25 × normal hastighed afhængig af respirationsfrekvens) ved hjælp af et brugerdefineret script skrevet i MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Alle undersøgelser af LV-genvektorlevering blev udført ved University of Adelaide Laboratory Animal Research Center og havde til formål at bruge resultaterne af SPring-8-eksperimentet til at vurdere, om LV-MP-levering i nærvær af et magnetfelt kunne forbedre genoverførsel in vivo .For at evaluere virkningerne af MF og magnetfelt blev to grupper af dyr behandlet: en gruppe blev injiceret med LV MF med magnetplacering, og den anden gruppe blev injiceret med en kontrolgruppe med LV MF uden magnet.
LV-genvektorer er blevet genereret under anvendelse af tidligere beskrevne metoder 25, 26.LacZ-vektoren udtrykker et nuklear lokaliseret beta-galactosidase-gen drevet af MPSV-konstitutiv promotor (LV-LacZ), som producerer et blåt reaktionsprodukt i transducerede celler, synligt på fronter og sektioner af lungevæv.Titrering blev udført i cellekulturer ved manuelt at tælle antallet af LacZ-positive celler under anvendelse af et hæmocytometer til at beregne titeren i TU/ml.Bærere kryokonserveres ved -80°C, optøs før brug og bindes til CombiMag ved at blande 1:1 og inkubere på is i mindst 30 minutter før levering.
Normale Sprague Dawley-rotter (n = 3/gruppe, ~2-3 bedøvede ip med en blanding af 0,4 mg/kg medetomidin (Domitor, Ilium, Australien) og 60 mg/kg ketamin (Ilium, Australien) ved 1 måneds alder) ip ) injektion og ikke-kirurgisk oral kanyle med en 16 Ga intravenøs kanyle.For at sikre, at luftrørsvævet modtager LV-transduktion, blev det konditioneret ved hjælp af vores tidligere beskrevne mekaniske forstyrrelsesprotokol, hvor luftrørets luftvejsoverflade blev gnidet aksialt med en trådkurv (N-Circle, nitinol-stenudtrækker uden spids NTSE-022115) -UDH , Cook Medical, USA) 30 s28.Derefter, omkring 10 minutter efter forstyrrelsen i biosikkerhedsskabet, blev der udført trakeal administration af LV-MP.
Det magnetiske felt, der blev brugt i dette eksperiment, blev konfigureret på samme måde som et in vivo røntgenstudie, med de samme magneter holdt over luftrøret med destillationsstentklemmer (figur 4).Et 50 µl volumen (2 x 25 µl alikvoter) af LV-MP blev leveret til luftrøret (n = 3 dyr) under anvendelse af en pipette med gelspids som beskrevet tidligere.Kontrolgruppen (n = 3 dyr) modtog den samme LV-MP uden brug af en magnet.Efter afslutning af infusionen fjernes kanylen fra endotrachealrøret, og dyret ekstuberes.Magneten forbliver på plads i 10 minutter, før den fjernes.Rotter blev doseret subkutant med meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australien) efterfulgt af anæstesitilbagetrækning ved intraperitoneal injektion af 1 mg/kg atipamazolhydrochlorid (Antisedan, Zoetis, Australien).Rotter blev holdt varme og observeret indtil fuldstændig restituering fra anæstesi.
LV-MP leveringsanordning i et biologisk sikkerhedsskab.Man kan se, at den lysegrå Luer-lock-muffe på ET-røret stikker ud af munden, og gelpipettespidsen vist på figuren føres gennem ET-røret til den ønskede dybde i luftrøret.
En uge efter LV-MP-administrationsproceduren blev dyrene aflivet humant ved inhalation af 100 % CO2, og LacZ-ekspression blev vurderet ved hjælp af vores standard X-gal-behandling.De tre mest kaudale bruskringe blev fjernet for at sikre, at enhver mekanisk skade eller væskeretention på grund af placering af endotracheal rør ikke ville blive inkluderet i analysen.Hvert luftrør blev skåret i længderetningen for at opnå to halvdele til analyse og anbragt i en kop indeholdende silikonegummi (Sylgard, Dow Inc) under anvendelse af en Minutien-nål (Fine Science Tools) for at visualisere den luminale overflade.Fordelingen og karakteren af ​​de transducerede celler blev bekræftet ved frontal fotografering ved hjælp af et Nikon-mikroskop (SMZ1500) med et DigiLite-kamera og TCapture-software (Tucsen Photonics, Kina).Billeder blev optaget ved 20x forstørrelse (inklusive den maksimale indstilling for luftrørets fulde bredde), med hele længden af ​​luftrøret vist trin for trin, hvilket giver tilstrækkeligt overlap mellem hvert billede til at tillade billeder at blive "syet".Billederne fra hvert luftrør blev derefter kombineret til et enkelt sammensat billede ved hjælp af Composite Image Editor version 2.0.3 (Microsoft Research) ved hjælp af planbevægelsesalgoritmen. Området med LacZ-ekspression i de trakeale sammensatte billeder fra hvert dyr blev kvantificeret ved hjælp af et automatiseret MATLAB-script (R2020a, MathWorks) som tidligere beskrevet28, ved at bruge indstillinger på 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 og Value < 0,7. Området med LacZ-ekspression i de trakeale sammensatte billeder fra hvert dyr blev kvantificeret ved hjælp af et automatiseret MATLAB-script (R2020a, MathWorks) som tidligere beskrevet28, ved at bruge indstillinger på 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 og Value < 0,7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Området for LacZ-ekspression i sammensatte luftrørsbilleder fra hvert dyr blev kvantificeret ved hjælp af et automatiseret MATLAB-script (R2020a, MathWorks) som tidligere beskrevet28 ved brug af indstillinger på 0,350,15 og værdi <0,7.Å如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的 表达 量化 ， 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.7 的。。。。。 .................... HOFTE Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Områder med LacZ-ekspression på sammensatte billeder af luftrøret fra hvert dyr blev kvantificeret ved hjælp af et automatiseret MATLAB-script (R2020a, MathWorks) som tidligere beskrevet ved brug af indstillinger på 0,35 < nuance < 0,58, mætning > 0,15 og værdi < 0,7.Ved at spore vævskonturer i GIMP v2.10.24 blev der manuelt oprettet en maske for hvert sammensat billede for at identificere vævsområdet og forhindre eventuelle falske påvisninger uden for luftrørsvævet.De farvede områder fra alle sammensatte billeder fra hvert dyr blev summeret for at give det totale farvede område for dette dyr.Det malede område blev derefter divideret med det samlede område af masken for at opnå et normaliseret område.
Hvert luftrør blev indlejret i paraffin og delt 5 µm tykt.Sektioner blev modfarvet med neutral hurtig rød i 5 minutter, og billeder blev erhvervet ved hjælp af et Nikon Eclipse E400 mikroskop, DS-Fi3 kamera og NIS element capture software (version 5.20.00).
Alle statistiske analyser blev udført i GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Statistisk signifikans blev sat til p ≤ 0,05.Normalitet blev testet ved hjælp af Shapiro-Wilk-testen, og forskelle i LacZ-farvning blev vurderet ved hjælp af en uparret t-test.
De seks MP'er beskrevet i tabel 1 blev undersøgt med PCXI, og synligheden er beskrevet i tabel 2. To polystyren MP'er (MP1 og MP2; henholdsvis 18 µm og 0,25 µm) var ikke synlige ved PCXI, men de resterende prøver kunne identificeres (eksempler er vist i figur 5).MP3 og MP4 er svagt synlige (10-15% Fe3O4; henholdsvis 0,25 µm og 0,9 µm).Selvom MP5 (98 % Fe3O4; 0,25 µm) indeholdt nogle af de mindste testede partikler, var det den mest udtalte.CombiMag MP6-produktet er svært at skelne.I alle tilfælde blev vores evne til at detektere MF'er væsentligt forbedret ved at flytte magneten frem og tilbage parallelt med kapillæren.Efterhånden som magneterne bevægede sig væk fra kapillæren, blev partiklerne trukket ud i lange kæder, men da magneterne nærmede sig, og magnetfeltstyrken steg, blev partikelkæderne forkortet, da partiklerne migrerede mod den øvre overflade af kapillæren (se Supplerende video S1 : MP4), hvilket øger partikeltætheden ved overfladen.Omvendt, når magneten fjernes fra kapillæren, falder feltstyrken, og MP'erne omarrangeres i lange kæder, der strækker sig fra den øvre overflade af kapillæren (se Supplerende video S2: MP4).Efter at magneten holder op med at bevæge sig, fortsætter partiklerne med at bevæge sig i nogen tid efter at have nået ligevægtspositionen.Når MP bevæger sig mod og væk fra den øvre overflade af kapillæren, har de magnetiske partikler en tendens til at trække snavs gennem væsken.
Synligheden af ​​MP under PCXI varierer betydeligt mellem prøverne.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 og (d) MP6.Alle billeder vist her blev taget med en magnet placeret ca. 10 mm direkte over kapillæren.De tilsyneladende store cirkler er luftbobler fanget i kapillærerne, hvilket tydeligt viser de sorte og hvide kanttræk af fasekontrastbilledet.Den røde boks angiver forstørrelsen, der øger kontrasten.Bemærk, at diameteren af ​​magnetkredsløbene i alle figurer ikke er i skala og er cirka 100 gange større end vist.
Når magneten bevæger sig til venstre og højre langs toppen af ​​kapillæren, ændres MP-strengens vinkel, så den flugter med magneten (se figur 6), og afgrænser således de magnetiske feltlinjer.For MP3-5, efter at akkorden når tærskelvinklen, trækker partiklerne langs den øvre overflade af kapillæren.Dette resulterer ofte i, at MP'er grupperer sig i større grupper i nærheden af, hvor magnetfeltet er stærkest (se Supplerende Video S3: MP5).Dette er også særligt tydeligt ved billeddannelse tæt på enden af ​​kapillæren, hvilket får MP til at aggregere og koncentrere sig ved væske-luft-grænsefladen.Partiklerne i MP6, som var sværere at skelne end dem i MP3-5, trak ikke, når magneten bevægede sig langs kapillæren, men MP-strengene dissocierede, så partiklerne kunne ses (se Supplerende video S4: MP6).I nogle tilfælde, når det påførte magnetiske felt blev reduceret ved at flytte magneten en lang afstand fra billeddannelsesstedet, faldt eventuelle resterende MP'er langsomt ned til bunden af ​​røret ved hjælp af tyngdekraften og forblev i strengen (se Supplerende video S5: MP3) .
Vinklen på MP-strengen ændres, når magneten bevæger sig til højre over kapillæren.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 og (d) MP6.Den røde boks angiver forstørrelsen, der øger kontrasten.Bemærk venligst, at de yderligere videoer er til informationsformål, da de afslører vigtig partikelstruktur og dynamisk information, som ikke kan visualiseres i disse statiske billeder.
Vores test har vist, at flytning af magneten langsomt frem og tilbage langs luftrøret letter visualiseringen af ​​MF i forbindelse med kompleks bevægelse in vivo.Der blev ikke udført in vivo test, fordi polystyrenperlerne (MP1 og MP2) ikke var synlige i kapillæren.Hver af de resterende fire MF'er blev testet in vivo med magnetens lange akse placeret over luftrøret i en vinkel på ca. 30° i forhold til lodret (se figur 2b og 3a), da dette resulterede i længere MF-kæder og var mere effektivt end en magnet..konfigurationen er afsluttet.MP3, MP4 og MP6 er ikke fundet i luftrøret hos nogen levende dyr.Ved visualisering af luftvejene hos rotter efter humant dræbning af dyrene, forblev partiklerne usynlige, selv når yderligere volumen blev tilføjet ved hjælp af en sprøjtepumpe.MP5 havde det højeste jernoxidindhold og var den eneste synlige partikel, så den blev brugt til at evaluere og karakterisere MP-adfærd in vivo.
Placering af magneten over luftrøret under MF-indsættelse resulterede i, at mange, men ikke alle, MF'er blev koncentreret i synsfeltet.Tracheal indtrængen af ​​partikler observeres bedst i humant aflivede dyr.Figur 7 og supplerende video S6: MP5 viser hurtig magnetisk indfangning og justering af partikler på overfladen af ​​det ventrale luftrør, hvilket indikerer, at MP'er kan målrettes mod ønskede områder af luftrøret.Ved søgning mere distalt langs luftrøret efter MF-levering blev nogle MF'er fundet tættere på carinaen, hvilket indikerer utilstrækkelig magnetisk feltstyrke til at opsamle og holde alle MF'er, da de blev leveret gennem området med maksimal magnetfeltstyrke under væskeadministration.behandle.Imidlertid var postnatale MP-koncentrationer højere omkring billedområdet, hvilket tyder på, at mange MP'er forblev i luftvejsområder, hvor den påførte magnetiske feltstyrke var højest.
Billeder af (a) før og (b) efter levering af MP5 i luftrøret på en nyligt aflivet rotte med en magnet placeret lige over billedområdet.Det afbildede område er placeret mellem to bruskringe.Der er noget væske i luftvejene, før MP afgives.Den røde boks angiver forstørrelsen, der øger kontrasten.Disse billeder er taget fra videoen i S6: MP5 Supplementary Video.
Flytning af magneten langs luftrøret in vivo resulterede i en ændring i MP-kædens vinkel på luftvejsoverfladen, svarende til den, der observeres i kapillærer (se figur 8 og supplerende video S7: MP5).Men i vores undersøgelse kunne parlamentsmedlemmer ikke trækkes langs overfladen af ​​levende luftveje, som kapillærer kunne gøre.I nogle tilfælde forlænges MP-kæden, når magneten bevæger sig til venstre og højre.Interessant nok fandt vi også ud af, at partikelkæden ændrer dybden af ​​væskens overfladelag, når magneten bevæges i længderetningen langs luftrøret, og udvider sig, når magneten flyttes direkte over hovedet, og partikelkæden roteres til en lodret position (se Supplerende video S7).: MP5 kl. 0:09, nederst til højre).Det karakteristiske bevægelsesmønster ændrede sig, når magneten blev bevæget sideværts hen over toppen af ​​luftrøret (dvs. til venstre eller højre for dyret, snarere end langs længden af ​​luftrøret).Partiklerne var stadig tydeligt synlige under deres bevægelse, men da magneten blev fjernet fra luftrøret, blev spidserne af partikelstrengene synlige (se Supplerende Video S8: MP5, startende ved 0:08).Dette stemmer overens med den observerede opførsel af magnetfeltet under påvirkning af et påført magnetfelt i en glaskapillær.
Prøvebilleder, der viser MP5 i luftrøret på en levende bedøvet rotte.(a) Magneten bruges til at tage billeder over og til venstre for luftrøret, derefter (b) efter at have flyttet magneten til højre.Den røde boks angiver forstørrelsen, der øger kontrasten.Disse billeder er fra videoen i S7's Supplerende video: MP5.
Når de to poler blev indstillet i en nord-syd-orientering over og under luftrøret (dvs. tiltrækkende; fig. 3b), så MP-akkorderne længere ud og var placeret på luftrørets laterale væg i stedet for på den dorsale overflade af luftrøret. luftrør (se bilag).Video S9:MP5).Imidlertid blev høje koncentrationer af partikler på ét sted (dvs. den dorsale overflade af luftrøret) ikke detekteret efter væskeadministration ved anvendelse af en dobbeltmagnetanordning, hvilket normalt forekommer med en enkelt magnetanordning.Da en magnet derefter blev konfigureret til at afvise modsatte poler (figur 3c), steg antallet af synlige partikler i synsfeltet ikke efter levering.Opsætning af begge to magnetkonfigurationer er udfordrende på grund af den høje magnetiske feltstyrke, som henholdsvis tiltrækker eller skubber magneterne.Opsætningen blev derefter ændret til en enkelt magnet parallelt med luftvejene, men passerer gennem luftvejene i en 90 graders vinkel, så kraftlinjerne krydsede luftrørsvæggen ortogonalt (Figur 3d), en orientering beregnet til at bestemme muligheden for partikelaggregation på sidevæggen.blive observeret.I denne konfiguration var der imidlertid ingen identificerbar MF-akkumuleringsbevægelse eller magnetbevægelse.Baseret på alle disse resultater blev en konfiguration med en enkelt magnet og en 30-graders orientering valgt til in vivo undersøgelser af genbærere (fig. 3a).
Når dyret blev afbildet flere gange umiddelbart efter at være blevet aflivet på en human måde, betød fraværet af forstyrrende vævsbevægelser, at finere, kortere partikellinjer kunne skelnes i det klare interbruskfelt, der 'svajer' i overensstemmelse med magnetens translationelle bevægelse.tydeligt se tilstedeværelsen og bevægelsen af ​​MP6-partikler.
Titeren af ​​LV-LacZ var 1,8 x 108 IE/ml, og efter blanding 1:1 med CombiMag MP (MP6) blev dyrene injiceret med 50 µl af en trakeal dosis på 9 x 107 IE/ml LV-vehikel (dvs. 4,5 x 106 TU/rotte).).).I disse undersøgelser fik vi i stedet for at flytte magneten under fødslen fastgjort magneten i én position for at bestemme, om LV-transduktion kunne (a) forbedres sammenlignet med vektorlevering i fravær af et magnetfelt, og (b) hvis luftvejen kunne være fokuseret.Cellerne transduceres i de magnetiske målområder i de øvre luftveje.
Tilstedeværelsen af ​​magneter og brugen af ​​CombiMag i kombination med LV-vektorer så ikke ud til at påvirke dyresundheden negativt, ligesom vores standard LV-vektorleveringsprotokol.Frontale billeder af luftrørsregionen udsat for mekanisk forstyrrelse (Supplerende Fig. 1) viste, at den LV-MP-behandlede gruppe havde signifikant højere niveauer af transduktion i nærvær af en magnet (Fig. 9a).Kun en lille mængde blå LacZ-farvning var til stede i kontrolgruppen (figur 9b).Kvantificering af X-Gal-farvede normaliserede regioner viste, at administration af LV-MP i nærvær af et magnetfelt resulterede i en ca. 6 gange forbedring (fig. 9c).
Eksempel på sammensatte billeder, der viser trakeal transduktion med LV-MP (a) i nærvær af et magnetfelt og (b) i fravær af en magnet.(c) Statistisk signifikant forbedring i det normaliserede område af LacZ-transduktion i luftrøret ved brug af en magnet (*p = 0,029, t-test, n = 3 pr. gruppe, middel ± standardfejl af middelværdien).
Neutrale hurtige rødfarvede snit (eksempel vist i Supplerende Fig. 2) indikerede, at LacZ-farvede celler var til stede i den samme prøve og på det samme sted som tidligere rapporteret.
Nøgleudfordringen i luftvejsgenterapi er fortsat den præcise lokalisering af bærerpartikler i områder af interesse og opnåelse af et højt niveau af transduktionseffektivitet i den mobile lunge i nærværelse af luftstrøm og aktiv slimclearance.For LV-bærere beregnet til behandling af luftvejssygdomme ved cystisk fibrose har øget opholdstid for bærerpartiklerne i de ledende luftveje hidtil været et uopnåeligt mål.Som påpeget af Castellani et al., har brugen af ​​magnetiske felter til at forbedre transduktion fordele i forhold til andre genleveringsmetoder, såsom elektroporation, fordi det kan kombinere enkelhed, økonomi, lokaliseret levering, øget effektivitet og kortere inkubationstid.og muligvis en lavere dosis vehikel10.Imidlertid er in vivo aflejring og opførsel af magnetiske partikler i luftvejene under påvirkning af eksterne magnetiske kræfter aldrig blevet beskrevet, og faktisk er denne metodes evne til at øge genekspressionsniveauer i intakte levende luftveje ikke blevet påvist in vivo.
Vores in vitro-eksperimenter på PCXI-synkrotronen viste, at alle de partikler, vi testede, med undtagelse af MP polystyren, var synlige i den billedopsætning, vi brugte.I nærvær af et magnetfelt danner magnetiske felter strenge, hvis længde er relateret til typen af ​​partikler og styrken af ​​magnetfeltet (dvs. magnetens nærhed og bevægelse).Som vist i figur 10 dannes de strenge, vi observerer, når hver enkelt partikel bliver magnetiseret og inducerer sit eget lokale magnetfelt.Disse separate felter får andre lignende partikler til at samle sig og forbindes med gruppestrengbevægelser på grund af lokale kræfter fra de lokale tiltræknings- og frastødningskræfter af andre partikler.
Diagram, der viser (a, b) kæder af partikler, der dannes inde i væskefyldte kapillærer og (c, d) et luftfyldt luftrør.Bemærk, at kapillærerne og luftrøret ikke er tegnet i skala.Panel (a) indeholder også en beskrivelse af de MF-holdige Fe3O4-partikler arrangeret i kæder.
Når magneten bevægede sig over kapillæren, nåede partikelstrengens vinkel den kritiske tærskel for MP3-5 indeholdende Fe3O4, hvorefter partikelstrengen ikke længere forblev i sin oprindelige position, men bevægede sig langs overfladen til en ny position.magnet.Denne effekt opstår sandsynligvis, fordi overfladen af ​​glaskapillæren er glat nok til at tillade denne bevægelse at forekomme.Interessant nok opførte MP6 (CombiMag) sig ikke på denne måde, måske fordi partiklerne var mindre, havde en anden belægning eller overfladeladning, eller den proprietære bærevæske påvirkede deres evne til at bevæge sig.Kontrasten i CombiMag-partikelbilledet er også svagere, hvilket tyder på, at væsken og partiklerne kan have samme densitet og derfor ikke let kan bevæge sig mod hinanden.Partikler kan også sætte sig fast, hvis magneten bevæger sig for hurtigt, hvilket indikerer, at magnetfeltstyrken ikke altid kan overvinde friktionen mellem partikler i væsken, hvilket tyder på, at magnetfeltstyrken og afstanden mellem magneten og målområdet ikke bør komme som en overraskelse.vigtig.Disse resultater indikerer også, at selvom magneter kan fange mange mikropartikler, der strømmer gennem målområdet, er det usandsynligt, at man kan stole på magneter til at flytte CombiMag-partikler langs overfladen af ​​luftrøret.Således konkluderede vi, at in vivo LV MF-undersøgelser skulle bruge statiske magnetiske felter til fysisk at målrette specifikke områder af luftvejstræet.
Når først partiklerne er leveret ind i kroppen, er de svære at identificere i sammenhæng med kroppens komplekse bevægelige væv, men deres detektionsevne er blevet forbedret ved at flytte magneten vandret over luftrøret for at "vrikke" MP-strengene.Mens real-time billeddannelse er mulig, er det lettere at skelne partikelbevægelser, efter at dyret er blevet dræbt på en human måde.MP-koncentrationer var normalt højest på dette sted, når magneten var placeret over billedområdet, selvom nogle partikler normalt blev fundet længere nede i luftrøret.I modsætning til in vitro-undersøgelser kan partikler ikke trækkes ned i luftrøret ved bevægelse af en magnet.Dette fund er i overensstemmelse med, hvordan slimet, der dækker overfladen af ​​luftrøret, typisk behandler inhalerede partikler, fanger dem i slimet og efterfølgende renser dem gennem muco-ciliær clearance-mekanismen.
Vi antog, at brug af magneter over og under luftrøret til tiltrækning (fig. 3b) kunne resultere i et mere ensartet magnetfelt, snarere end et magnetfelt, der er stærkt koncentreret på et punkt, hvilket potentielt kan resultere i en mere ensartet fordeling af partikler..Vores foreløbige undersøgelse fandt dog ikke klare beviser for at understøtte denne hypotese.På samme måde resulterede indstilling af et par magneter til at frastøde (fig. 3c) ikke i mere partikelsætning i billedområdet.Disse to resultater viser, at opsætningen af ​​dobbeltmagneter ikke forbedrer den lokale kontrol af MP-pegning væsentligt, og at de resulterende stærke magnetiske kræfter er svære at indstille, hvilket gør denne tilgang mindre praktisk.På samme måde øgede orientering af magneten over og på tværs af luftrøret (figur 3d) heller ikke antallet af partikler, der var tilbage i det afbildede område.Nogle af disse alternative konfigurationer er muligvis ikke vellykkede, da de resulterer i en reduktion i magnetfeltstyrken i aflejringszonen.Således betragtes enkeltmagnetkonfigurationen ved 30 grader (fig. 3a) som den enkleste og mest effektive in vivo-testmetode.
LV-MP-studiet viste, at når LV-vektorer blev kombineret med CombiMag og leveret efter at være blevet fysisk forstyrret i nærvær af et magnetisk felt, steg transduktionsniveauerne signifikant i luftrøret sammenlignet med kontroller.Baseret på synkrotron-billeddannelsesundersøgelser og LacZ-resultater så magnetfeltet ud til at være i stand til at holde LV i luftrøret og reducere antallet af vektorpartikler, der straks trængte dybt ind i lungen.Sådanne målretningsforbedringer kan føre til højere effektivitet og samtidig reducere leverede titere, ikke-målrettet transduktion, inflammatoriske og immunbivirkninger og omkostninger til genoverførsel.Vigtigt, ifølge producenten, kan CombiMag bruges i kombination med andre genoverførselsmetoder, herunder andre virale vektorer (såsom AAV) og nukleinsyrer.